医用生物蛋白胶携载加替沙星的体外释药率测定

目的:建立测定医用生物蛋白胶携载加替沙星(MBG-Gat)的体外释药率的方法。方法:采用高效液相色谱法测定含量,色谱柱为ZORBAX300SB-C18,流动相为磷酸二氢钾缓冲溶液(pH3.5)-乙腈=76:24,检测波长为293nm,柱温为30℃,流速为1mL.min-1,进样量为20μL。将MBG-Gat置于生理盐水中释放,每12小时1次取释放液测定,连续9d。结果:Gat检测浓度线性范围为5～80μg.mL-1(r=0.9997);平均回收率为99.77%～103.53%,RSD≤2.77%(n=5)。MBG-Gat在生理盐水中释放9d时累积释药率在70%以上。结论:所建立的体外释药率的测定方法灵敏度高,重复性好,适用于在体外条件下Gat的分析检测。Gat以MBG携载后具有缓释性。     

RP-HPLC法测定人血浆中血管紧张素Ⅱ的浓度

目的:建立以反相高效液相色谱(RP-HPLC)-荧光法检测人血浆中血管紧张素Ⅱ浓度的方法。方法:采用固相萃取法纯化血浆样本,以荧光胺柱前衍生后进样测定。以乙腈-10mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液(pH8.5)作为流动相,梯度洗脱,流速为1mL·min-1,色谱柱为LunaC5,激发波长为273nm,发射波长为476nm。结果:血管紧张素Ⅱ血药浓度在10～200ng·mL-1范围内线性关系良好(r=0.9995),最低检出限(S/N=3)为5ng·mL-1,日内、日间RSD分别为1.65%和4.20%。结论:本方法快速、灵敏、准确、重复性好,可用于血浆中血管紧张素Ⅱ浓度的检测。     

CENP-I表达下调对HEK293细胞生长及染色体分离的影响

目的 构建CENP-Ⅰ特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制CENP-Ⅰ基因表达对HEK293细胞生长、细胞周期和染色体数目异常率的影响.方法 构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,脂质体法将pGenesil-1空载体和pGene-sil-1/CENP-I-siRNA-1、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-2、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3真核表达载体分别导入人胚肾HEK293细胞.转染后24、48、72 h收集细胞用Western blot和FQ-PCR检测HEK293细胞内CENP-Ⅰ蛋白及mRNA水平的表达情况,以确定干扰效果及最佳干扰时间.MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布,Giemsa染色法计数细胞分裂指数,常规法制备染色体标本.结果 成功构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,筛选出具有干扰效果的质粒载体即pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3,转染人胚肾HEK293细胞72 h后可使CENP-Ⅰ蛋白及mRNA表达显著下调.CENP-Ⅰ表达降低的HEK293细胞生长速度明显减慢(P<0.05),G2/M期细胞增加,分裂期细胞比例增大.结论 RNA干扰有效地特异性抑制着丝粒特异性蛋白质CENP-Ⅰ的表达.CENP-Ⅰ的抑制可使人胚肾HEK293细胞生长减慢,增殖能力减弱,使细胞分裂期延长.     

双硫腙水相分光光度法测定维参锌胶囊中锌的含量

目的:建立以双硫腙水相分光光度法测定维参锌胶囊中锌含量的方法。方法:在非离子表面活性剂吐温-80存在下,以醋酸-醋酸钠(pH4.5)为缓冲介质,利用锌离子与双硫腙形成稳定的配合物,在535nm波长处采用分光光度法测定并计算维参锌胶囊中锌的含量。结果:锌检测浓度的线性范围为0.172～1.204μg.mL-1(r=0.999 3);平均回收率为99.20%,RSD=0.94%。结论:本方法操作简便、灵敏、准确,可用于维参锌胶囊中锌的含量测定。     

有丝分裂关卡基因致染色体数目异常自然流产胚胎发生的机制

目的 探讨有丝分裂关卡基因(hBUB1)在染色体数目异常自然流产胚胎发生中的可能机制.方法 采用实时定量逆转录(RT)-PCR和免疫印迹法(WB)检测染色体数目异常组和正常对照组的自然流产胚胎组织中目的 基因在mRNA和蛋白水平的表达;构建针对hBUB1基因的短发卡状(shRNA)表达载体,用细胞免疫化学、WB和实时定量RT-PCR方法评价其对胚胎细胞内源性hBUB1表达的干扰效果;用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTF)试验测定细胞增殖抑制率;用流式细胞术解析细胞周期分布.结果 hBUB1蛋白在染色体数目异常组中的表达显著低于正常对照组(阳性表达率分别为8%和93.5%,P＜0.05).shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制胚胎细胞中hBUB1基因的表达(干扰前后mRNA水平分别为0.196±0.067和0.042±0.006,P＜0.05).胚胎细胞转染有效干扰质粒48 h后,染色体数目异常组细胞增殖抑制率达62%,显著高于正常对照组(4%,P＜0.05).有效干扰质粒引起G2/M期细胞从对照组的40.2%和41.3%降低至21.3%.结论 hBUB1基因表达下调可导致细胞增殖的抑制和周期的改变,在染色体数目异常自然流产胚胎发生中可能起很重要的作用,这将为寻找可靠的临床检测指标奠定基础.     

染色体数目异常自然流产胚胎有丝分裂关卡蛋白基因的研究

目的探讨染色体数目异常自然流产胚胎中有丝分裂关卡蛋白(hsMAD2)基因的功能。方法分别用定量PCR和Western blotting在mRNA和蛋白水平检测染色体数目异常(实验组)和正常(对照组)的自然流产胚胎组织中目的基因的表达;构建针对hsMAD2基因的shRNA表达载体,抑制胚胎细胞内源性hsMAD2基因的表达,用Western blotting和定量PCR方法评价shRNA的干扰效果;用MTT法测定细胞增殖率;流式细胞术检测细胞周期。结果hsMAD2蛋白在实验组中的表达显著低于对照组。shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制胚胎细胞中hsMAD2基因的表达。胚胎细胞转染有效干扰质粒48 h后,细胞增殖抑制率达58%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论hsMAD2基因表达下调可能在染色体数目异常的自然流产胚胎发生中起着很重要的作用,为寻找可靠的临床检测指标奠定了基础。     

操纵子comCDE调控肺炎链球菌转化的分子机制研究

目的:探讨操纵子comCDE对调控肺炎链球菌转化的分子机制.方法:将D39野生菌株与comE基因缺陷菌株(ΔcomE)分别用感受态刺激因子(Competence-stimulating peptide,CSP)诱导转化,记录不同时间点的转化率,并采用FQ-PCR技术检测其comE的mRNA表达水平,并通过双向电泳及图像分析比较CSP诱导后不同时间点的蛋白质表达谱差异及野生菌株与ΔcomE菌株的蛋白质表达谱差异.结果:D39菌株在CSP诱导后不同时间点都能发生转化,其中0 min时转化率最高,其comE的mRNA表达量在CSP诱导10 rain后表达显著增加,20 rain时迅速回落(P＜0.05). ΔcomE菌株不能被CSP诱导发生转化.蛋白质组学研究显示,ΔcomE菌株有6个蛋白较D39菌株的表达量显著增加;CSP诱导10min时有6个蛋白表达显著增加,而在20 min时又迅速回落;二者有2个蛋白相同;有1个蛋白在加入CSP后表达显著降低.结论:基因comE的存在是CSP诱导转化必需的,CSP诱导转化可能有非comE依赖途径,而comE可能有除转化以外调控功能,且不依赖于CSP.     

CENP-Ⅰ表达下调对HEK293细胞生长及染色体分离的影响

目的 构建CENP-Ⅰ特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制CENP-Ⅰ基因表达对HEK293细胞生长、细胞周期和染色体数目异常率的影响.方法 构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,脂质体法将pGenesil-1空载体和pGene-sil-1/CENP-I-siRNA-1、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-2、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3真核表达载体分别导入人胚肾HEK293细胞.转染后24、48、72 h收集细胞用Western blot和FQ-PCR检测HEK293细胞内CENP-Ⅰ蛋白及mRNA水平的表达情况,以确定干扰效果及最佳干扰时间.MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布,Giemsa染色法计数细胞分裂指数,常规法制备染色体标本.结果 成功构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,筛选出具有干扰效果的质粒载体即pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3,转染人胚肾HEK293细胞72 h后可使CENP-Ⅰ蛋白及mRNA表达显著下调.CENP-Ⅰ表达降低的HEK293细胞生长速度明显减慢(P<0.05),G2/M期细胞增加,分裂期细胞比例增大.结论 RNA干扰有效地特异性抑制着丝粒特异性蛋白质CENP-Ⅰ的表达.CENP-Ⅰ的抑制可使人胚肾HEK293细胞生长减慢,增殖能力减弱,使细胞分裂期延长.     

高效液相色谱法同时测定血浆同型半胱氨酸及其相关硫醇物浓度方法的建立

目的建立一种柱前衍生反相高效液相色谱-荧光检测法同时测定血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hey）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、半胱氨酰甘氨酸（cysteinylglycine，CysGly）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的方法。方法 以tris-（2-carboxylethyl）-phosphine（TCEP）为还原剂，7-fluorbenzo-2-OX8-1，3-diazole-4-sulfonate（SBD-F）为衍生剂，N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcystine，NAC）为内标，C8柱分离。流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液（25 mmo/L，pH 3．0），梯度洗脱，激发波长（kex）380nm，发射波长（hem）510 nm，内标标准曲线法定量。结果Hey、Cys、CysGly、GSH的线性范围分别为1．0—160．0μmol／L，30．0—1 040．0μmol／L，2．0—300．0μmol／L，1．0—130．0μmol／L，具有良好的相关性，r为0．999 4—0．999 9。最低检测限为0．1—2．0μmol/L。日内精密度不超过3．0％，日间精密度除GSH为13．21％外均小于6．0％。平均回收率为87．24％-114．99％。结论本方法准确、灵敏、快速、特异，适合于实验室研究和临床常规检测。     

染色体数目异常滋养层细胞中CENP-I基因的的异常表达

目的:探讨人胚胎滋养层细胞中染色体数目异常与着丝粒特异性蛋白质CENP-I表达水平的相关性。方法:T-A克隆制备CENP-I、GAPDH定量PCR标准品;用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化CENP-I重组蛋白,免疫兔制备抗人CENP-I多克隆抗体;采用FQ-PCR和Western-blot检测23例染色体数目异常的滋养层细胞(实验组)和30例具有正常核型的滋养层细胞(对照组)中CENP-ImRNA和蛋白表达水平。结果:成功制备CENP-I、GAPDHFQ-PCR标准品,表达和纯化CENP-I重组蛋白,获得兔抗人CENP-I多克隆抗体;FQ-PCR和Western-blot结果显示CENP-I在实验组和对照组中均有表达,但实验组中CENP-I的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:CENP-I表达的降低可能是导致人胚胎滋养层细胞中染色体数目异常的原因之一。