细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导

目的 研究细胞穿透肽PEP-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力.方法 用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将500 μg的EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻醉小鼠,PBS充分灌流并取心、脑、肝、脾、肾快速冷冻切片后立即置荧光显微镜下观察.结果 2 h后PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠大脑、心肌、肝、脾和肾组织里出现均一的明亮绿色荧光,而EGFP蛋白处理的小鼠各脏器内均未见到绿色荧光.结论 细胞穿透肽PEP-1能携带增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠细胞膜并分布于心、脑、肝、脾、肾组织内,为将来用PEP-1介导各种大分子药物跨膜转导进行各种疾病的蛋白治疗提供实验依据.     

吡咯喹啉醌对D-半乳糖致衰老大鼠海马神经元的影响

目的观察吡咯喹啉醌(PQQ)对D-半乳糖(D-gal)致大鼠海马神经细胞衰老的影响。方法用大剂量D-gal致大鼠脑老化模型,侧脑室注射PQQ,50 d后行脑组织切片H-E染色和尼氏染色,观察海马神经元的形态学变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡率;用TBA法和Fenton反应测海马组织自由基含量;W estern b lot观察C-FOS蛋白的表达。结果D-gal处理组鼠海马神经元胞体变小,尼氏小体的吸光度值(A)降低,细胞凋亡率和自由基含量增加,C-FOS蛋白的表达降低;而同时PQQ处理后,与对照组相比海马神经元的胞体变大,尼氏小体的A值增加,自由基含量和神经元的凋亡率无明显增加,PQQ剌激了C-FOS蛋白的表达。结论PQQ能延缓D-gal引起的大鼠海马神经细胞衰老。     

侧脑室内注射血管紧张素(1～7)对大鼠动脉血压和心率的影响

目的:探讨血管紧张素(1～7)对大鼠动脉血压和心率的影响机制。方法:以血压和心率为指标,在氨基甲酸乙酯麻醉、三碘季胺酚制动、呼吸机控制呼吸的SD大鼠上观察血管紧张素(1～7)对大鼠血压和心率的影响,连续观察60min血压和心率曲线变化,并与对照组和0.9%氯化钠注射液组比较。结果:给药后大鼠血压和心率明显升高,其中血压在5、10、15、30、45min与对照组和0.9氯化钠注射液组比较有极显著性差异(P<0.01);心率在30、45、60min与对照组和0.9%氯化钠注射液组比较也有极显著性差异(P<0.01)。结论:血管紧张素(1～7)具有中枢性升高大鼠血压和心率的作用,侧脑室预先注射血管紧张素(1～7)特异性阻断剂A-779可部分阻断血管紧张素(1～7)的升压和心率升高效应。     

微滴式数字PCR技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变

目的分析微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,dd PCR)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者外周血EGFR基因突变检测中的应用价值。方法采用dd PCR法与扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)分别检测58例NSCLC患者及TKI治疗后耐药患者20例外周血EGFR基因突变,Kappa检验验证dd PCR法检测EGFR基因突变结果与ARMS法的一致性,并对检测结果进行分析比较。结果 ARMS法检测EGFR基因突变共检出34例患者,其中双突变患者5例,dd PCR法共检出38例患者,其中双突变患者10例;两者Kappa值=0.72,阳性一致率为97.50%,阴性一致率为72.73%,总一致率为86.30%;dd PCR法检测接受TKI治疗患者的20外显子p.T790M位点突变检出率为50.00%(10/20),而无TKI用药史患者均未检出;dd PCR法检出突变丰度1%的突变位点占总突变位点的29.17%(14/48),ARMS法仅检出其中的35.71%(5/14)。结论 dd PCR法与ARMS法相比具有更高敏感性,且可绝对定量,EGFR基因突变的检出率更高。     

整合医学模式下生理学教学新理念与教学体系的构建

以生理学课程教学为例,深入探讨在整合医学模式下,为实现培养未来整合性医学人才的目标,采取抓住核心概念的讲解、打通系统的壁垒、引入创建应用新的生理学教育理念、推动基础与临床的教学融合、建立与之匹配的教学和学习方法及评价体系等措施,构建新的生理学教学模式。并初步实现了在督促学生重视基础理论知识学习的同时,加强其对知识的深度理解和拓展应用。更加注重以问题为导向的临床思维、科学创新精神的养成,及科研、医疗实践能力的培养等综合素质的提高。     

细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF-1α的重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF-1α cDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF-1α重组腺病毒. 方法: 制备感受态BJ5183,将pAdEasy-1转化BJ5183,制备含pAdEasy-1的BJ5183感受态,将线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdEasy-1的BJ5183感受态菌. 采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α. pAd-EGFP-hSDF-1α用Pac Ⅰ线性化后,再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况. 结果:pShuttle-EGFP-hSDF-1α成功地转化了含pAdEasy-1的BJ5183,并在其内发生了同源重组. 荧光显微镜下观察证实了pAd-EGFP-hSDF-1α转染AD293后,产生了重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 病毒滴度为4.1×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF-1α的高滴度重组腺病毒. 为研究hSDF-1α在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.     

吡咯喹啉醌对D-半乳糖致大鼠皮层衰老的影响

目的观察吡咯喹啉醌(PQQ)对D-半乳糖致大鼠皮层神经细胞衰老的影响。方法用D-半乳糖致大鼠脑老化模型,侧脑室注射PQQ,50d后组织切片行H-E和尼氏染色观察皮层神经细胞的形态学变化,测皮层细胞的凋亡率和自由基,免疫组化法和SDS-PAGE检测Bcl-2/Bax和c-fos基因的表达。结果D-半乳糖处理组皮层神经细胞胞体变小,尼氏小体的光密度值降低,细胞的凋亡率和自由基的含量增加,Bcl-2/Bax和c-fos蛋白的表达降低;而PQQ处理组神经细胞胞体的直径和尼氏小体的含量高于对照组,PQQ降低了由D-半乳糖引起皮层组织自由基和细胞凋亡率的增加,Bcl-2/Bax和c-fos表达增加。结论PQQ能延缓由D-半乳糖引起的大鼠皮层神经细胞的衰老。     

阿霉素诱导大鼠心衰模型不同方案的比较

目的通过阿霉素(Adriamycin,ADR)不同方案腹腔注射给药(Adriamycin,ADR)试图造成大鼠心衰,探讨建立大鼠阿霉素心衰动物模型的给药方案,为研究心衰的发病机制和有效治疗措施提供理想的动物模型。方法雄性Wistar大鼠40只,随机分成3组,模型A组(n=15),模型B组(n=15),对照组(n=10)。模型A组:腹腔注射ADR(4 mg/kg体重,用注射用水配制成2 mg/mL溶液,即2 mL/kg体重),每周1次,共6周,累积总量24 mg/kg体重;模型B组:腹腔注射ADR(2.5 mg/kg体重,用注射用水配制成2 mg/mL溶液,即1.25 mL/kg体重),每周3次,共2周,累积总量15 mg/kg体重;对照组:注射相同体积的注射用水。于末次注射停药后2周,测量体重(BW)、心室质量(VW)、动脉收缩压(SAP)、动脉舒张压(DAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)及左室最大压力上升及下降速度(±dp/dtmax),并作病理切片观察其组织学变化。结果与对照组相比,模型A组SAP、LVSP、±dp/dtmax均明显降低,LVEDP明显升高;病理学结果证实符合心肌病样改变。模型B组则改变不明显,但心外损害严重,死亡率高。结论多次间断腹腔注射一定剂量的阿霉素可明显损害心脏的功能,是建立大鼠慢性充血性心力衰竭模型的一种简便可靠的方法。     

PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性

目的:研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导进人大鼠心肌组织的能力,并测定转导的目的蛋白酶活性.方法:实验分为SOD1组和PEP-1-SOD1组,分别经大鼠尾静脉注射500 μg纯化后的SOD1及500μg纯化后的PEP-1-SOD1融合蛋白入大鼠体内,于注射后0.5,1,2,4,8,24 h时间点取心脏(n=6,每组,每个时间点),经40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后行冰冻切片,通过免疫组织化学方法检测PEP-1-SOD1进入大鼠心肌组织的能力和分布情况.黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织SOD1活性.结果:PEP-1-SOD1组注射后0.5 h时,大鼠心肌组织中即出现均一的明亮红色荧光信号,分布于细胞浆及细胞核,具有时间依赖性的特点,荧光强度最强点为1 h时间点,而SOD1组未见到红色荧光信号.于注射后0.5 h时SOD1活性开始升高PEP-1-SOD1组为(85.37±1.67),SOD1组为(52.23±0.67),两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01);注射后1 h时SODl活性可达高峰,PEP-1-SOD1组为(119.16±1.37),SOD1组为(53.47±1.02),两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01),2～24 h逐步下降;SOD1组各时间点间相比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:PEP-1-SOD1融合蛋白能以天然活性形式迅速高效的转导人大鼠心肌组织,并保持酶活性达24 h.     

间充质干细胞成血管因子受体表达特征及其意义

目的:探讨间充质干细胞成血管因子受体表达特征及其意义。方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养骨髓源间充质干细胞(MSC),通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞分析其表面标记(CD34、CD90、CD29)等鉴定MSC特征;以P1-P17MSC为实验材料,利用RT-PCR的方法检测PDGFR、VEGFR和NRP1的表达。利用Transwell体外迁移体系初步探索VEGF在MSC迁移中的作用,同时利用MTT法评价VEGF对MSC增值的作用。结果:培养的MSC呈现出CD90、CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;强表达PDGFR-β和NRP1、不表达VEGFR(Flk1和Flt1)和PDGFR-α,VEGF促进了MSC的增殖和迁移。结论:VEGF可能通过PDGFR-NRP1促进了MSC的增值和迁移。