EB病毒转化B淋巴细胞影响因素的研究

人外周血Ｂ淋巴细胞膜上有ＥＢ病毒 (ＥＢＶ)受体 ,在体外可被ＥＢＶ转化为Ｂ淋巴母细胞样细胞系 (ＬＣＬ) ,ＬＣＬ具有永生性 ,能在体外长期传代生长 ,且能保持较稳定的遗传学性状。因而ＬＣＬ可被广泛应用于医学生物学研究的许多领域 ,如进行基因组遗传物质结构的分析 ,某些细胞生物学性状的检测等。目前建立ＬＣＬ的方法主要有环孢霉素Ａ法、微量全血法及冻存全血法。但微量全血法和冻存全血法因具有操作简单 ,所需标本量少的优点 ,而被广泛采用。我们就影响微量全血法转化效果的因素作了初步探讨。实验中共收集血标本 78份 ,其中正常人 …     

Establishment of in vitro cellular model predicting histocompatibity in allograft

Histocompatibility is crucial in effecting survivalof allografts.Due to differences in histocompatibilitybetween donor and recipient,rejection would happento some extent after transplantation. Therefore,theevaluation of differences in histocompatibility betweendonor and recipient would be contributive to selectionof donor and judgement on prognosis oftransplantation. HLA typing and mixed lymphocyticreaction (MLR) are the classical methods to evaluatethe histocompatibility between donor and r…     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

输注人PBMC建立“人-鼠”异种移植物抗宿主病模型1

目的:摸索X-GVHD模型的合适小鼠品系,建立稳定的“人-鼠”X-GVHD模型。方法:选取了裸鼠、NOD/SCID经亚致死剂量γ射线全身照射后,腹腔输注健康人外周血单核细胞(PBMC)建立异种X-GVHD模型。通过检测人T细胞在模型鼠外周血、组织、器官中的浸润情况等指标(采用流式细胞术和免疫组化技术),比较两种模型鼠中人免疫细胞的浸润率和各组生存时间,从而确定建立X-GVHD模型的合适小鼠品系,并摸索人PBMC的输注途径和合适细胞量,以及观察免疫细胞表型变化与功能的最佳时间窗口。结果:NOD/SCID鼠更适合诱导“人-鼠”X-GVHD模型的小鼠;腹腔输注途径和尾静脉输注途径对建立“人-鼠”X-GVHD模型无明显差异;腹腔输注5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型。在采用优化后的实验条件建立模型中,监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间窗口为7~11 d;模型鼠的平均生存时间为(14.16±1.77)d。结论:NOD/SCID鼠通过腹腔注射5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型,7~11 d为监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间。     

可溶性组织相容性抗原-G1抑制人自然杀伤细胞释放穿孔素颗粒酶介导异种排斥反应

目的：研究可溶性组织相容性抗原-G1（sHLA-G1）抑制人自然杀伤细胞（NK细胞）释放穿孔素、颗粒酶，从而降低人NK细胞对猪血管内皮细胞的杀伤作用。方法：利用核转染技术将质粒pcDNA3-sHLA-G1转入LCL721.221细胞株，并提取sHLA-G1。以RT-PCR、斑点酶联免疫吸附（Dot-ELISA）技术分别在基因水平和蛋白水平检测sHLA-G1的表达；以人类NK细胞系（NK92）为效应细胞，猪内皮细胞系PED为靶细胞，用β-己糖氨酶释放实验检测sHLA-G1抑制NK92释放穿孔素、颗粒酶；单四唑（MTT）法检测sHLA-G1抑制NK细胞的杀伤活性。结果：与未加入sHLA-G1的对照组相比，NK92释放的β-己糖氨酶显著减少（P〈0．05），且对sHLA-G1组PED的杀伤效率均有明显降低（P〈0．01）。结论：sHLA-G1可通过抑制NK92释放穿孔素、颗粒酶以减轻NK92对PED的杀伤作用。     

死亡受体5在肝癌细胞系及肝细胞系表面的表达

目的：利用抗死亡受体5（Death Receptor5）单克隆抗体（mAb），检测DR5在肝癌细胞系的表达。方法：sDR5免疫BALB／c小鼠，小鼠脾细胞与SP2／0-Ag14细胞在50％PEG条件下融合，获得能够分泌抗DR5单克隆抗体的杂交瘤细胞株，利用杂交瘤细胞株分泌的抗DR5特异性单克隆抗体，采用流式细胞仪枝术测定抗DR5 mAb结合至细胞表面的量来分析死亡受体DR5在肝癌细胞系及肝细胞袁面的表达情况。结果：不同细胞表面DR5的表达水平分别为：人肝癌sMMC7721细胞95％、人肝细胞癌HepG2细胞40％，人正常肝细胞HL-770220．3％。结论：抗DR5mAb能够特异性与DR5结合。DR5在人肝癌sMMC7721细胞高水平表达，人肝细胞癌HepG2细胞中度表达，人正常肝细胞HL-7702细胞低表述。谅特异性mAb在研究TRAIL受体的生物功能上是一种有用的工具，对研究DR5在组织和细胞系表达十分有价值。     

遗传性对称性色素异常症一个家系DSRAD基因突变分析

目的:通过对一遗传性对称性色素异常症家系的致病基因DSRAD进行检测,以期寻找到新的致病突变.方法:采用RT-PCR方法从人外周血中获得DSRAD基因cDNA,然后克隆至pTA2 vector,经阳性克隆筛选后进行基因序列测定,通过BLAST程序网上比对找出可能突变位点,再采用单链构象多态性技术进行新突变验证.结果:对该家系DSRAD基因测序发现患者存在碱基替换A1167G(Q389Q),由于编码的氨基酸未改变,均为谷氨酰胺,为一种同义突变.经单链构象多态性分析证明该突变只存在于该家系患者,不存在于家系健康人和100名无亲缘关系对照者.结论:该同义突变可能导致患者皮肤色素异常改变,其具体的机制尚需进一步研究.     

人补体第4成分基因在各种HLA单倍型上的结构特点及其规律性

对５５个已知ＨＬＡ单倍型的细胞株进行人补体第４成分（Ｃ４）基因限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）检测，在所检测的２４种ＨＬＡ单倍型中观察到７种Ｃ４基因结构形式；探讨了Ｃ４蛋白质的遗传多态性与其基因结构多态性之间的关系；阐述了Ｃ４基因结构与ＨＬＡ祖传单倍型（ＡＨ）之间严格的规律性，相同的ＨＬＡ单倍型携带着同样的Ｃ４基因结构形式，即Ｃ４基因的结构多态性具有ＨＬＡ单倍型性质，而且有的Ｃ４基因结构形式为某一种ＨＬＡ单倍型所特有，即ＨＬＡ单倍型特异性；结果支持了ＨＬＡ祖传单倍型在遗传进化的过程中是高度保守的。     

长期混合淋巴细胞培养-细胞毒实验模型的建立

目的：建立一种能较逼真地模拟移植排斥反应的体外实验模型。方法：利用EB病毒转化的BI林巴母样细胞系作为刺激细胞,诱导同种异体或异种外周血单个核细胞增殖,并分化为效应细胞,然后检测效应细胞对刺激细胞源靶细胞的杀伤活性,建立长期混合淋巴细胞培养,细胞毒实验模型。结果：用不同刺激细胞诱导产生的效应细胞能有效杀伤刺激细胞来源的靶细胞,进一步克隆实验证实这种杀伤效应是由CD8^ 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）所致,结论：长期混合淋巴细胞培养－细胞毒实验模型能较逼真地模拟器官移植受者体内发生的由CTL介导的急性排斥反应。