Effects of Astragaloside in Treating Myocardial Injury and Myocardial Sarco/Endoplasmic Ca~( 2 )-ATPase of Viral Myocarditis Mice

Effects of Astragaloside in Treating Myocardial Injury and Myocardial Sarco/Endoplasmic Ca~( 2 )-ATPase of Viral Myocarditis Mice@陆曙 @张寄南 @杨笛 @徐晋丹 @陈相健 @方五旺 @马文珠     

正常SD大鼠心血管系统内皮素转换酶表达水平及意义

目的：探讨正常ＳＤ大鼠心脏及血管（动脉、静脉）内皮素转换酶（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ＥＣＥ）ｍＲＮＡ的分布。方法：半定量ＲＴ－ＰＣＲ法检测组织中的ＥＣＥ ｍＲＮＡ,同时以甘油醛－３－磷酸脱氢酶（Ｇｌｙｃｅｒ－ａｌｄｅｌｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＧＡＰＤＨ）作内参照。结果：正常ＳＤ大鼠心脏各部位及血管（动脉、静脉）ＥＣＥ ｍＲＮＡ的     

正常人及SD大鼠心脏和血管内皮素转换酶分布研究

目的：了解正常人和大鼠心血管系统内皮素转换酶（ECE）及其mRNA的分布和表达。方法：以3－磷酸谷胱甘肽脱氢酶（GAPDH）作为内参照，采用半定量RT－PCR法检测ECE mRNA表达，同时进行ECE活力测定。结果：正常人心脏各部位及动脉ECE mRNA表达由高到低的顺序为：左房≌左房＞左室＞右室≌室间隔＞动脉，ECE的活性由高到低的顺序为：左房≌右房＞右室≌左室≌室间隔＞动脉。大鼠的分布规律与人基本一致。结论：正常人和大鼠心脏各部分及动脉均存在ECE，ECT表达及活性以心房最高，动脉最低，心房高于心室。     

T型钙通道在心肌肥厚大鼠心肌细胞钙内流中的作用

目的研究T型钙通道在心肌细胞钙离子内流中的作用及其对心脏兴奋收缩耦联的可能影响。方法测定选择性T型钙通道阻滞剂米贝拉地尔对培养的SD乳大鼠心室肌细胞和二肾一夹心肌肥厚大鼠心室肌细胞[Ca2+]i的影响。结果血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激使乳大鼠心室肌舒张期细胞[Ca2+]i增高,收缩期细胞[Ca2+]i降低,[Ca2+]i上升和下降的时间延长。米贝拉地尔1.25～5μmol·L-1浓度依赖性降低AngⅡ引起的细胞[Ca2+]i变化。在心肌肥厚模型大鼠,咖啡因刺激后,[Ca2+]i增幅和最高[Ca2+]i明显降低。而米贝拉地尔25mg·kg-1·d-1(灌胃给药7～9周)组加入咖啡因刺激后细胞内[Ca2+]i增幅和最高[Ca2+]i明显增高。结论T型钙通道异常开放可以引起心肌细胞内钙超载。阻断T型钙通道,可能通过改善肌浆网摄取及释放钙的功能而抑制心肌细胞钙超载。     

大鼠心肌组织中高能磷酸化物的含量测定

目的 建立了同步测定大鼠心肌组织中5种高能磷酸化物含量的反相离子对高效液相色谱法,并观察异丙肾上腺素致害大鼠心肌损伤模型中能量代谢的变化。方法 色谱柱:Supelco ODS-C₁₈(250mm×4.6mm,5μm);柱温:23℃～25℃;UV检测波长210nm;流动相:220mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(含3mmol·L^-1四丁基氢氧化铵和7%甲醇),pH6.5;流速1.2ml·min^-1和1.3ml·min^-1。结果 5种能量代谢物质ATP、ADP、AMP、CrP和Cr达到良好分离,ATP、ADP、CrP在10～100μmol·L^-1,AMP在100～500μmol·L^-1,Cr在100～1000μmol·L^-1浓度范围,峰面积与浓度呈良好线性关系。日内和日间精密度的RSD均<10%,ATP、ADP、AMP、CrP及Cr的提取回收率(%)平均为:97.86、104.38、100.00、97.64和98.8。与生理盐水组相比,ISO致害大鼠心室组织中ATP含量及能荷(EC)显著下降(P<0.05)、ADP呈下降而AMP呈上升趋势，CrP含量显著上升（P<0.01）。结论 本法操作简便、结果准确，可以用于大鼠心肌组织提取液中高能磷酸化物的测定和能量代谢状况的研究。     

黄芪总皂苷对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的保护作用

 目的研究黄芪总皂苷(astragalosides,AS)对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)致大鼠心肌损伤的影响及机制。方法用AS(5mg·kg^-1·d^-1×7d,ip)或曲美他嗪(10mg·kg^-1·d^-1×7d,ip)等治疗ISO(5mg·kg^-1·d^-1×2d,sc)心肌损伤大鼠,观察心肌组织病理改变并测定心肌组织乳酸、丙二醛及高能磷酸化物ATP,ADP和AMP含量。结果AS组心肌组织病理分级接近曲美他嗪对照治疗组,心肌乳酸和丙二醛含量较模型组显著降低(分别为P<0.05,P<0.01),ATP含量增加(P<0.05),ADP含量降低(P<0.05),AMP含量有增加趋势,以上治疗指标与曲美他嗪组比较无显著差异(P>0.05)。结论AS可拮抗ISO引起的大鼠心肌损伤,其机制与改善心肌能量代谢、抑制脂质过氧化有关。     

C-反应蛋白对体外培养乳鼠心肌细胞的影响

目的：应用C-反应蛋白干预体外培养的乳鼠心肌细胞，观察C-反应蛋白对心肌细胞的影响。 方法：实验于2005-05／10在南京医科大学第一附属医院心内科暨心血管病研究所完成。取新生1-3d的SD乳鼠，无菌操作取出心脏，去除大血管和心房后将心脏剪碎，加入适量0．125％胰蛋白酶反复消化至完全。所得消化液中加入含血清的DMEM培养基，离心后弃上清，沉淀用含0．1％Brdu、体积分数为0．15新生牛血清的DMEM培养基混悬。细胞密度稀释至6&;#215;10^8L^-1，接种至六孔板中，放入37℃，体积分数为0．05的CO2孵育箱内培养。24h后换液除去Brdu，取第3天细胞进行研究。采用充氮气孵育4h模拟缺氧造成心肌细胞损伤（缺氧组），以未缺氧组做对照，缺氧组与未缺氧组均加用不同浓度的C-反应蛋白（0，10，55，100mg／L）进行干预，测定细胞培养上清心肌肌钙蛋白Ⅰ的含量及脂质过氧化产物丙二醛与超氧化物歧化酶的含量以观察C-反应蛋白对心肌细胞的影响。并通过免疫组织化学观察C-反应蛋白在细胞的分布情况。 结果：①细胞形态及搏动率的改变：未缺氧组细胞搏动率总体随C-反应蛋白浓度的增加而增加，但在缺氧4h组，细胞搏动率在C-反应蛋白55mg／L时达到最高峰[（132&;#177;9）次／min，P〈0．051。②培养细胞上清肌钙蛋白Ⅰ含量的变化：在未缺氧组和缺氧4h组，肌钙蛋白Ⅰ均随C-反应蛋白浓度的增加而增高，且C-反应蛋白浓度为100mg／L时的增幅最高[C-反应蛋白为0，10，55，100mg／L时的肌钙蛋白Ⅰ浓度：缺氧组分别为（0．789&;#177;0．066），（1．198&;#177;0．101），（1．979&;#177;0．151），（3．714&;#177;0．288）μg／L；未缺氧组分别为（0.332&;#177;0．034），（0．377&;#177;0．054），（0．527&;#177;0．057），（0．867&;#177;0．077）μg／L，P〈0．051。③细胞上清超氧化物歧化酶、丙二醛含量变化：各组丙二醛含量的变化趋势与肌钙蛋白Ⅰ相似，随C-反应蛋白浓度的增加而增加，而超氧化物歧化酶活力则随C-反应蛋白浓度的增加而降低。④免疫组织化学结果显示：随着C-反应蛋白浓度的增高，细胞着色变深，细胞密度变低，体积变小。相同C-反应蛋白浓度下，损伤组细胞的变化比未缺氧组更明显。 结论：C-反应蛋白对心肌细胞具有显著的损伤作用，尤其在已有缺氧损伤的基础上。     

黄芪总皂甙对培养大鼠心肌细胞钙超载的影响

目的：研究黄芪总皂甙是否对培养大鼠心肌细胞钙超载产生影响，为研究和开发中药的新成分提供理论依据。方法：异丙肾上腺素干预培养大鼠(1～3d的SD乳大鼠80只)心肌细胞造成心肌细胞钙超载的模型，同时用黄芪总皂甙、维拉帕米和美托洛尔分别作用于细胞72h。分为异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)组，黄芪总皂甙1(astragaosidesl，ASl)组，AS2组，ISO+ASl组，ISO+AS2组，[SO+美托洛尔(metoprolol，M)组，ISO+维拉帕米(verapamil，V)组及正常对照组(control，C)组。检测肌细胞内游离钙离子浓度和肌质网的钙负荷，测定心肌细胞内脂质过氧化物丙二醛(maleic dialdehvde，MDA)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。结果：异丙肾上腺素引起心肌细胞游离钙离子浓度和肌质网钙负荷明显增加(分别增加89％和116％)。黄芪总皂甙可浓度依赖性的抑制异丙肾上腺素的作用，从低浓度(10mg／L)到高浓度(100mg／L)。与ISO组比较，ISO+AS1组与ISO+AS2组可使细胞内的钙离子浓度分别降低37％和50％[(169．2&;#177;24．2)，(132．6&;#177;29．2)，(267．6&;#177;82．0)nmol／L，t=2．57，P&;lt;0．05；t=3．81，P&;lt;0．01]，使肌质网钙负荷分别降低23％和35％(P&;gt;0．05；t=2．48，P&;lt;0．05)，但是黄芪总皂甙的这种作用不如维拉帕米，美托洛尔可基本阻断异丙肾上腺素的作用。异丙肾上腺素使心肌细胞内的丙二醛含量增加(t=2．57，P&;lt;0．05)，黄芪总皂甙对异丙肾上腺素引起的丙二醛的增加有降低趋势，并对SOD的活性有增加趋势。结论：黄芪总皂甙可抑制异丙肾上腺素引起的心肌细胞钙超载，机制之一是黄芪总皂甙减少了心肌细胞肌质网的钙负荷，并抑制了脂质过氧化。     

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ磷酸化及降解与肥厚型心肌病

目的观察心肌肌钙蛋白Ⅰ在肥厚型心肌病小鼠心肌组织中的磷酸化与降解作用.方法实验于2005-03/2006-01在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所及南京医科大学动物中心SPF级动物房进行.取4周龄BALB/c雌鼠12只,随机分为模型组6只,正常对照组6只,适应性饲养1周后模型组小鼠转染带有EGFP报告基因的CTnIArg146Trp突变基因.饲养至20周龄时二维超声心动图检测证实模型组小鼠室间隔肥厚,断颈处死两组小鼠后,称取小鼠心脏质量(湿),心尖部心肌组织光镜病理学检查,小鼠心肌组织进行Western Blotting检测重组蛋白、肌钙蛋白Ⅰ的磷酸化及降解表达,GAPDH作为内参半定量.结果12只小鼠进入结果分析.①模型组小鼠心脏明显增大,心脏质量(湿)/体质量比显著高于正常对照组(P＜0.01);模型组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、间质血管增生、少量炎性细胞浸润;两组血清肌钙蛋白Ⅰ水平均正常(P＞0.05).②模型组小鼠心肌组织用抗EGFP单克隆抗体在Mr 55 000,24 000检测到突变CTnI-EGFP及其降解片断表达.③模型组在Mr55 000,30 000,28 000分别检测到磷酸化突变CTnI-EGFP、内源性肌钙蛋白Ⅰ及其降解片断表达,正常对照组在Mr30 000见磷酸化肌钙蛋白Ⅰ表达,模型组内源性磷酸化肌钙蛋白Ⅰ表达明显高于对照组(1.18±0.15,0.97±0.15,P＜0.05).④去磷酸化抗肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体在Mr55 000,28 000,检测到去磷酸化突变肌钙蛋白Ⅰ-EGFP、内源性肌钙蛋白Ⅰ降解片断表达,正常对照组未见去磷酸化肌钙蛋白Ⅰ表达;用针对不同位点的抗肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体3E3,2I-14,8I-7,MF4分别在Mr55 000,30 000,28 000检测到突变CTnI-EGFP、内源性肌钙蛋白Ⅰ及其降解片断表达,正常对照组在Mr 30 000,见肌钙蛋白Ⅰ表达,未见降解片断.结论Adc CTnI Arg146Trp-EGFP突变基因在小鼠体内成功转染心肌组织并有明显表达及降解片断出现,小鼠心脏呈现明显室间隔肥厚;小鼠内源性肌钙蛋白Ⅰ磷酸化表达增强、降解与心肌肥厚的发生、发展及心肌功能的改变可能有关,但两者之间因果关系及确切机制还有待于进一步研究.