p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的探讨p38 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的转录调控。方法以人胚胎肾293(HEK 293)细胞为靶细胞,采用脂质体(LPS)介导的细胞基因共转染技术、荧光素酶报告基因技术,分别将FLAG-tagged p38 MAPK 4种亚型、含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒(piNOS-Luc)、空载体(pcDNA3)、β-半乳糖苷酶表达质粒(pCMV-β)共转染,检测并比较荧光素酶相对活性。结果(1)未加刺激时,在HEK 293细胞中,p38 MAPK中仅有p38α能够诱导iNOS基因启动子的转录活性;(2)在LPS刺激下,p38 MAPK 4种亚型均能够诱导iNOS启动子的转录活性,其中,p38β所诱导的转录活性最高,p38α的诱导作用亦很明显。结论(1)LPS能够在HEK 293细胞中诱导iNOS基因转录活性;(2)在HEK 293细胞中,p38 MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iN-OS基因的转录调控。     

慢病毒介导BMP2和VEGF165基因共转染对骨髓基质干细胞成骨分化的影响

目的观察慢病毒介导骨形成蛋白2(BMP2)和血管内皮生长因子165(VEGF165)基因共转染对骨髓基质干细胞(MSCs)成骨分化的影响。方法构建携带BMP2、VEGF165和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒表达载体,包装、生产携带BMP2、VEGF165和GFP基因的重组慢病毒(Lv-BMP、Lv-VEGF、Lv-GFP)。分离、培养W istar大鼠骨髓MSCs,分别以Lv-GFP(GFP组)、Lv-BMP(BMP组)、Lv-VEGF(VEGF组)转染MSCs,Lv-BMP和Lv-VEGF共转染MSCs(BMP+VEGF组),另设未转染MSCs对照组。RT-PCR法检测转染后7 d各组细胞BMP2、VEGF165 mRNA表达以及转染后1、2、4周各组细胞骨钙素(OCN)mRNA表达;ELISA法检测转染后1、4、8周各组细胞培养上清液BMP2、VEGF165蛋白表达以及转染后1、2、4周各组细胞培养上清液OCN蛋白表达;转染后第14天,各组细胞行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性检测。结果 BMP+VEGF组BMP2、VEGF165 mRNA和蛋白高效共表达,BMP2 mRNA和蛋白表达与BMP...     

Zf9对TGFβ1的转录激活研究

目的：探讨新发现的转录因子Ｚｆ９对肝纤维化中重要的细胞因子ＴＧＦβ１启动子的转录激活作用。方法：以培养的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞、人成纤维细胞及人ＨｅｐＧ２细胞为靶细胞,共转染Ｚｆ９表达质料ｐＣＩｎｅｏＺｆ９与含ＴＧＦβ１启动子报告基因ＣＡＴ的重组体,测定报告基因ＣＡＴ的表达活性。结果：在３种细胞中的Ｚｆ９对ＴＧＦβ１启动子都有反式激活作用。Ｚｆ９对ＴＧＦβ１的反式激活有明显剂量依赖性。结论：转录因子Ｚ     

vWF促进intein剪接的BDD-FVⅢ的分泌和活性

vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整的功能性BDD-FVIII蛋白。为了研究vWF对于intein连接的BDD-FVIII分泌和活性的影响,通过intein融合的BDD-FVIII重、轻链基因和vWF基因共转染培养的293细胞,采用ELISA观察了分泌至培养上清液中的由intein剪接的全长BDD-FVIII抗原量,并用Coatest检测了由其产生的活性。结果显示,vWF基因共转染细胞上清液中,全长BDD-FVIII抗原量为(235±21)ng·mL-1,活性为(1.98±0.2)u·mL-1,明显高于未转染vWF的细胞[(110±18)ng·mL-1和(1.10±0.15)u·mL-1],也明显高于单独转染BDD-FVIII基因的对照细胞[(131±25)ng·mL-1和(1.22±0.18)u·mL-1],表明vWF基因共转染可显著改善双载体转BDD-FVIII基因后intein剪接的BD...     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调控机制。方法以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1~ -1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc,采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞,检测并比较荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达;(3)在LPS刺激下,人eNOS启动子的转录活性降低,而在tPNS和TGFβ1刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论正确构建了人eNOS基因启动子区(-1~-1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc;tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

成骨诱导因子Nell-1及Noggin短发卡RNA联合转染脂肪间充质干细胞的促成骨分化能力

背景:Nell-1在诱导成骨分化和新骨形成中的作用已有报道,但试图通过双基因联合转染起协同成骨作用的研究很少。目的:体外环境下抑制细胞中Noggin基因的同时上调Nell-1基因,观察其对脂肪间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:取健康成年大鼠脂肪组织获取脂肪间充质干细胞。将细胞分为3组,对照组转染空载体病毒Lv-EGFP(增强型绿色荧光蛋白),Nell-1组单纯转染Lv-Nell-1,Nell-1+Noggin shRNA组同时转染Lv-Nell-1和Lv-Noggin shRNA。转染后3,7,14 d,应用实时荧光定量PCR检测Nell-1及成骨相关标志物(Col-Ⅰ、ALP、OCN)的表达,转染后14 d行茜素红染色。结果与结论:①转染后3 d,对照组Nell-1 mRNA相对表达量与Nell-1组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。与Nell-1+Noggin shRNA组比较,对照组和Nell-1组Nell-1 mRNA表达量偏低,差异均有显著性意义(P<0.05)。转染后7,14 d,Nell-1+Noggin shRNA组Nell-1 mRNA相对表达量仍高于对照组和Nell-1组,且Nell-1组高于对照组,两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);②转染后3,7,14 d,Nell-1+Noggin shRNA组各成骨基因mRNA相对表达量均显著高于对照组和Nell-1组,且Nell-1组高于对照组,组间比较差异有显著性意义(P<0.05);③转染后14 d,Nell-1+Noggin shRNA组呈现较多细胞聚集形成的结节,Nell-1组钙结节数量少于Nell-1+Noggin shRNA组,对照组未见明显被染色的钙结节;④实验结果表明,Nell-1基因可以促进大鼠脂肪间充质干细胞成骨分化,而干扰Noggin基因会上调Nell-1基因的表达,形成显著的协同成骨分化作用。     

DNA氧化损伤修复基因hOGG1高表达细胞株的建立

目的联合pcDNA3.1(+)/Myc-HisA-hOGG1和pGL3promoter荧光质粒稳定转染人肺腺癌A549细胞获得hOGG1基因高表达细胞株,并初步探讨转染细胞生物学特性的变化。方法成功构建pcDNA3.1(+)/Myc-His A载体后,大量抽提阳性重组子并在Fu GENE6的介导下联合pGL3promoter荧光质粒转染A549细胞(转染组),同时设空白对照组(A549)和阴性对照组[PGL3+pcDNA3.1(+)/Myc-HisA转染的A549细胞]。生物荧光检测转染细胞hOGG1mRNA表达的改变,蛋白质免疫印迹法检测转染细胞hOGG1蛋白表达水平。将3组细胞于不同高氧条件下培养,相差显微镜观察形态学变化,彗星试验比较各组细胞对抗损伤和修复能力的情况,同时测定DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的变化。结果转染细胞荧光素酶稳定表达,蛋白印迹检测转染组hOGG1蛋白明显高于两对照组细胞,提示hOGG1基因高表达细胞株建立成功。相同高氧条件下,转染组形态学变化明显减轻,彗星细胞率和olive tail moment明显低于空白组和阴性对照组,修复完成率高,修复时间缩短(P<0...     

CO-TRANSFECTION OF RAT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS WITH HUMAN BMP2 AND VEGF165 GENES

Objective To explore the feasibility and efficacy of lentivirus-mediated co-transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene. Methods The hVEGF165 and hBMP2 cDNAs were obtained from human osteosarcoma cell line MG63 and cloned into lentiviral expression vectors designed to co-express the copepod green fluorescent protein (copGFP). The expression lentivector and packaging Plasmid Mix were co-transferred to 293TN cells, which produced the lentivirus carrying hVEGF165 (Lv-VEGF) or hBMP2 (Lv-BMP), respectively. MSCs of Wistar rats were co-transfected with Lv-BMP and Lv-VEGF (BMP+VEGF group), or each alone (BMP group and VEGF group), or with no virus (Control group). The mRNA and protein expressions of hVEGF165 and hBMP2 genes in each group were detected by real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral expression vectors carrying hVEGF165 or hBMP2 were correctly constructed and confirmed by restriction endonucleses analysis and DNA sequencing analysis. A transfer efficiency up to 90% was archieved in all the transfected groups detected by the fraction of fluorescent cells using fluorescent microscopy. From the results generated by real-time PCR and ELISA, VEGF165 and BMP2 genes were co-expressed in BMP+VEGF group. No significant difference of BMP2 expression was detected between BMP+VEGF and BMP groups (P>0.05). Similarly, there was no significant difference of VEGF165 expression between BMP+VEGF and VEGF groups (P>0.05). Conclusion VEGF165 and BMP2 genes were successfully co-expressed in MSCs by lentivirus-mediated co-transfection, which provided a further foundation for the combined gene therapy of bone regeneration.     

利用细胞杂交技术检测强骨胶囊对雌激素受体的影响

目的:探讨强骨胶囊对雌激素受体(ER)活性的影响。方法:将含有ERs配体结合域(LBD)的质粒pCMV-BD和pFR-Luci报告基因及内标质粒pFRTlaczeo共转染到Hela细胞中,检测强骨胶囊与雌激素受体的关系;MTT法检测强骨胶囊对细胞活力的影响。结果:低剂量(12.5ng/ml)的强骨胶囊对两种ER均无明显效果,但是高剂量(125ng/ml和1.25μg/ml)可以显著地激活ERs,并可以显著提高细胞活性。结论:强骨胶囊治疗骨质疏松的疗效可能与激活ERs的作用有关。