去泛素化酶YOD1调控肝脏脂代谢的初步研究

目的：探索去泛素化酶YOD1在肝脏营养代谢中发挥的作用。方法：通过Q?PCR检测高脂饮食C57BL/6小鼠、db/db小鼠肝脏中以及油酸（oleic acid,OA）处理后的Hepa1?6细胞内,YOD1的表达情况。在C57BL/6小鼠中,通过Q?PCR法检测YOD1的组织分布及不同营养状态下的表达情况。对Hepa1?6细胞中给予OA处理,通过甘油三酯试剂盒检测细胞内甘油三脂含量,并利用油红染色观察细胞内脂滴。经Q?PCR和蛋白免疫印迹法检测细胞内相关基因的mRNA及蛋白水平。结果：短期高脂饮食后,肝脏中YOD1的mRNA水平显著下降。而与对照组db/+小鼠相比,db/db小鼠肝脏中YOD1的mRNA水平无变化。但是,经OA处理后,Hepa1?6细胞内的YOD1的mRNA水平明显减少。另外,YOD1主要表达于肝脏中。小鼠禁食后,肝脏YOD1的mRNA水平显著增加,而再喂食后显著下降。此外,过表达YOD1的Hepa1?6细胞中OA诱导的脂质堆积明显减少,且SREBP?1c的剪切被抑制。结论：本研究初步发现,去泛素化酶YOD1的表达水平受营养状态调控,并通过抑制SREBP?1c的剪切影响肝细胞的脂代谢。     

成熟SVFs细胞与Hepa1⁃6细胞共培养模型的建立及对肝细胞脂代谢的影响

目的：建立小鼠成熟脂肪细胞血管基质部分（stromal vascular fraction,SVF）与小鼠肝细胞（Hepa1?6）共培养模型,研究成熟脂肪细胞对肝细胞脂质堆积以及代谢的影响。方法：从小鼠皮下脂肪分离提取原代SVF细胞,经体外分化成熟后,以Transwell小室建立成熟SVF细胞和Hepa1?6细胞间接共培养48 h体系。应用逆转录?聚合酶链反应法（RT?PCR法）检测SVF细胞PPARγ和PGC?1α等分化相关基因及Hepa1?6细胞CD36、FATP2、GPAT1等脂代谢相关基因的表达。酶法检测经共培养后的Hepa1?6细胞甘油三酯水平。结果：小鼠原代SVF细胞经诱导成熟后,出现明显较大脂滴;成熟SVF细胞中PPARγ和PGC?1α等分化标志物较未分化SVF细胞显著升高;Hepa1?6细胞甘油三酯水平明显高于未共培养组;Hepa1?6细胞GPAT1、CD36基因表达水平明显升高。结论：已成功建立成熟脂肪细胞与Hepa1?6细胞Transwell共培养模型。肝细胞与成熟脂肪细胞共培养可以诱导其脂质堆积增加,该过程可能通过上调肝细胞中CD36 和GPAT1的表达水平增加脂肪酸的吸收和甘油三酯的合成通路实现。     

丙型肝炎病毒F蛋白上调肝癌细胞HepG2中Bcl-2和Bax表达

目的 研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因1b型F蛋白对HepG2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响.方法 应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增HCV 1b型的F基因,构建pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C真核表达载体,分别将pEGFP-C3-F、pEGFP-C3-C、pEGFP-C3(阴性对照)瞬时转染HepG2细胞,48h后抽细胞总蛋白质,蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax表达的变化.结果 转染F基因的HepG2中Bcl-2表达水平略高于未转染的细胞,但Bax表达水平显著高于未转染的细胞.结论 HCV F蛋白具有调节原癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax的特性,可能与肝癌的形成有关.     

丙型肝炎病毒感染者F基因区变异临床意义的初步研究

目的探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）F基因区变异的临床意义。方法以78例未治疗慢性丙型肝炎患者为研究对象,采用单链构象多态性分析对HCV-F基因区进行准种分析,实时荧光定量聚合酶链反应对HCV RNA进行定量检测,利用酶联免疫吸附试验分别对患者血清中的抗F蛋白抗体、Th1（IL-12,IFN-γ）和Th2（IL-5,IL-10）细胞因子水平进行检测分析。结果 78例慢性丙型肝炎患者中有46例为抗HCV-F抗体阳性,阳性率为59%。HCV1b亚型患者F基因区准种数目高于非HCV1b亚型（P=0.002）。F基因区SSCP条带数与HCV RNA载量及ALT/AST水平呈正相关（均有P〈0.05）。另外,与F基因准种数量≤2的患者相比,F基因准种数量〉2的患者血清中,Th1细胞因子IL-12、IFN-γ水平降低（P=0.023,P=0.010）,Th2细胞因子IL-5、IL-10水平显著升高（P=0.024,P=0.012）。结论 HCV-F基因区准种多样性与病毒复制、肝损伤和机体Th2优势应答有关,具有一定的临床意义。     

利用CRISPR/Cas9技术构建22q-Enh3增强子元件敲除型A549稳定细胞系

目的 增强子元件敲除细胞系是探索增强子功能的理想细胞模型,为了探索位于22q12.2肺癌易感染色质区的增强子元件22q-Enh3的生物学功能,建立敲除22q-Enh3增强子元件的纯合细胞系.方法 利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated 9)基因敲除技术在非小细胞肺癌A549细胞系中敲除22q-Enh3增强子,并运用流式细胞术、细胞培养以及PCR技术筛选和鉴定敲除型克隆.结果 我们最终获得了3个敲除增强子元件22q-Enh3的纯合子细胞克隆.结论 本研究为进一步研究22q-Enh3增强子元件的生物学功能提供了细胞模型,并为应用CRISPR/Cas9基因敲除技术建立其他增强子元件敲除型纯合子细胞模型积累了宝贵经验.     

生长激素、催乳素和IGF-I对大鼠INS-1细胞中IGFBP-3基因表达的调控

激素和生长因子一直是胰岛生长发育的重大研究课题。目前 ,尚未发现任何一种激素或生长因子是胰岛细胞生长和分化的决定性因素 ,但不论在体还是离体 ,生长激素 (GH)及其相关的激素 ,如催乳素 (PRL)、胎催乳激素 (PL) ,对胰腺 β细胞具有促进细胞增生和胰岛素分泌的作用 [1 ]。 Swenne等 [2 ]已证明 ,人生长激素(h GH)能促进正常β细胞的增生 ,而在肝细胞中 ,GH通过其受体促使肝细胞分泌 IGF- 1。 IGF- I对细胞的增生作用主要通过自分泌和旁分泌两种途径。IGFs根据不同的靶器官与相应的特异性蛋白结合 (IGFBPs) ,来调节自身的生物…     

HLA-DP基因多态性与丙型肝炎病毒感染转归的关系

摘要:目的　探讨人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigens,HLA）DP基因多态性与高危人群丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）感染转归的关系。方法　采用病例对照研究设计,运用Taqman-MGB技术检测401例HCV持续感染者,268例HCV自限感染者和984例健康对照者HLA-DP基因rs3077、rs9277535、rs2395309位点的基因多态性,比较不同基因型与HCV感染转归的关系。结果　采用Logistic回归分析调整性别、年龄和高危人群种类混杂因素后结果显示,rs3077位点:杂合基因型CT和突变型TT在感染组（持续感染组+自限清除组）中的频率均显著高于对照组（调整OR值及其95%CI分别为1.31,1.05～1.64和1.93,1.36～2.73）;rs2395309位点:杂合基因型GA和突变型AA在感染组中的频率均显著高于对照组（调整OR值及其95%CI分别为1.29,1.03～1.61和1.89,1.34～2.68）;rs9277535位点:杂合基因型GA和突变型AA在持续性感染组中的频率均高于自限清除组（P＝0.018,P＝0.037）。结论　rs3077、rs9277535、rs2395309三个位点的基因多态性可能与丙型肝炎转归有一定的关联。     

丙型肝炎病毒感染者F基因区变异临床意义的初步研究

目的探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）F基因区变异的临床意义。方法以78例未治疗慢性丙型肝炎患者为研究对象,采用单链构象多态性分析对HCV-F基因区进行准种分析,实时荧光定量聚合酶链反应对HCV RNA进行定量检测,利用酶联免疫吸附试验分别对患者血清中的抗F蛋白抗体、Th1（IL-12,IFN-γ）和Th2（IL-5,IL-10）细胞因子水平进行检测分析。结果 78例慢性丙型肝炎患者中有46例为抗HCV-F抗体阳性,阳性率为59%。HCV1b亚型患者F基因区准种数目高于非HCV1b亚型（P=0.002）。F基因区SSCP条带数与HCV RNA载量及ALT/AST水平呈正相关（均有P<0.05）。另外,与F基因准种数量≤2的患者相比,F基因准种数量>2的患者血清中,Th1细胞因子IL-12、IFN-γ水平降低（P=0.023,P=0.010）,Th2细胞因子IL-5、IL-10水平显著升高（P=0.024,P=0.012）。结论 HCV-F基因区准种多样性与病毒复制、肝损伤和机体Th2优势应答有关,具有一定的临床意义。     

最小努力(惰性)原则与慢性病预防行为选择

目的:探讨长链非编码RNA MEG3在胃癌组织及细胞系中的表达水平,以及过表达MEG3对胃癌细胞增殖能力的影响,并探索其可能的作用机制?方法:用定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测胃癌组织及细胞系中MEG3的表达水平;通过转染pcDNA-MEG3上调MEG3的表达水平,并通过qRT-PCR检测转染效率?用MTT和克隆形成试验检测上调MEG3的水平对BGC-823细胞和MGC-803细胞的增殖能力的影响,Western blot检测这两种细胞中上调MEG3的水平对p53蛋白的表达水平的影响?结果:相比正常胃组织及细胞,在胃癌组织和细胞中MEG3的表达出现显著下调,SGC7901?MGC-803和BGC-823细胞中MEG3的表达水平分别是正常胃上皮细胞GES-1中的73.6%?42.0%和27.1%(P < 0.05)?BGC-823细胞和MGC-803细胞中转染pcDNA-MEG3能显著上调MEG3的表达,MEG3的表达水平分别为对照组的252倍和311倍(P < 0.05);MTT和克隆形成试验显示,上调MEG3的表达能降低BGC-823细胞和MGC-803细胞的增殖能力?Western blot实验显示,转染了pcDNA-MEG3的MGC-803和BGC-823细胞中p53的表达相较对照组中显著增加?结论:胃癌组织及细胞中MEG3的表达下调,且这可能通过抑制p53蛋白的激活从而促进胃癌细胞增殖,影响胃癌的发生和发展?     

ETS1对非洲爪蛙早期胚胎发育的影响

目的:通过在非洲爪蛙胚胎中过表达ETS1探讨该基因对爪蛙胚胎早期发育的影响?方法:将克隆PCR获得的ETS1全长片段连接到质粒上,获得pCS2+-ETS1质粒;利用RT-PCR和Western blot检测ETS1 mRNA和蛋白在胚胎发育不同时期的表达情况;显微注射ETS1 mRNA入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交?定量PCR检测胚层标志性基因的表达;通过Western blot检测过表达ETS1对细胞凋亡和增殖的影响?结果:ETS1从受精卵时期即已开始表达,在器官形成期表达增强,过表达ETS1抑制了细胞分化以及神经胚期中胚层和外胚层标志基因表达,凋亡相关蛋白表达增加,增殖相关蛋白无明显变化?结论:ETS1表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,过表达ETS1抑制了中胚层和外胚层发育,促进细胞凋亡但不影响细胞增殖?