三种组织内源性生长因子含量变化与创面修复的关系

目的　研究内源性生长因子含量变化对创伤修复结局的影响。方法　用放射免疫和改进的 Ｃｏｒｔａｓ 法测定３４ 例瘢痕和肉芽创面组织匀浆中 Ｅ Ｇ Ｆ、 Ｔ Ｎ Ｆ 和 Ｎ Ｏ 含量变化，并探讨这三种因子含量变化与组织修复效果的关系。结果　以上三种因子含量在瘢痕组织显著高于溃疡创面肉芽组织，其中以男性或青少年以及伤后１ ～２ 年患者的标本更为明显。结论　创面内源性生长因子含量不足或过多分别是溃疡形成与瘢痕生长的原因之一。     

分离培养汗腺导管部细胞的新方法

Objective To explore a new method of isolation and culture of eccrine sweat gland ductual cells from human split-thickness skin graft in vitro. Methods Human split-thickness skin graft which was presented by volunteer (n=10) was digested with type Ⅱ collagenase, and then sweat gland duct were isolated from the split-thickness skin graft, primary cultures were incubated at 37 ℃ in humidified atmosphere of 5% CO2,95% O2. The cultured eccrine sweat gland ductual cells were identified by analysis CEA, CKB, CK18, CK19 antigens expression with flow cytometry, RT-PCR and Western Blot, and by detecting the electrophysialogy with whole cell patch clamp technology. Results The isolated eccrine sweat gland ductual cells could grow by adhering to the wall, proliferate in vitro after 48 h of adhering to the wall, and confluens after 2-4weeks of adhering to the wall. The FACs analysis showed the expression of CEA was (90.26±1.12)%, (89.70±1.43)%, and CK8 was (94.41±1.84)%, (93.65±1.63)% in primary cultured sweat gland ductual cells and primary cultured eccrine sweat gland cells, repectively, and there is no significant difference between the two groups (P > 0.05). Immunocytochemistry staining showed CEA,CK8,CK18,CK19 was positive in sweat gland duct cells, RT-PCR revealed that CEA, CKB, CK18 and CK19 gene expression in sweat gland ductual cells, and Western Blot analysis showed the expression of CEA brand,CK8 brand,CK18 brand,and CK19 brand in sweat gland ductual cells, patch clamp indicated that this cells has distinct amiloride sensitive Na+ channels. Conclusions The cultured human eccrine sweat gland duct cells in vitro display the markers and biological characteristics of sweat gland epithelial lineage, and this method of digest the split-thickness skin graft to get the sweat gland duct cells is better than classical dissect sweat gland under dissect microscope.     

汗腺的种植(附2例报告)

目的大面积深度烧伤治疗的半数致死面积(LA50)已达98%,但由于伤面切除植皮后无汗液分泌,使患者的生活质量显著下降。目前,由于烧伤治疗技术已趋成熟,存活者日益增多,因而汗腺再生的问题必须解决,而通过干细胞移植诱导再生汗腺是其中的重要方法之一。方法分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)和人汗腺细胞(SGCs)并进行鉴定。通过共培养方式促进骨髓间充质干细胞向汗腺细胞分化。将具有汗腺表型的干细胞局部移植于裸鼠烫伤脚掌,观察汗腺组织再生修复情况,结合碘-淀粉发汗试验检测汗腺功能以判定治疗效果。在动物实验初步证明转化的汗腺细胞能发挥修复汗腺功能后,选择2例烧伤自愿患者。1例患者双上臂背侧均有相似的烧伤后遗留的瘢痕,经发汗腺试验证明无汗液分泌。抽取其骨髓并切取小块正常皮肤分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞进行共培养,诱导骨髓间充质干细胞获得汗腺细胞表型,通过自行设计的方案将该细胞种植于右侧切除瘢痕处。创面愈合后治疗侧行发汗试验、汗液成分分析以及组织学检查。另1例为颏颈挛缩、瘢痕切除解除挛缩的患者,在其1/3的创面上种植诱导的汗腺细胞,2个月后进行发汗试验。结果通过共培养方式培养的骨髓间充质干细胞表达汗腺细胞特异性标志,可获得汗腺细胞表型。发汗试验和形态学观察证实将具有汗腺细胞表型的干细胞移植于裸鼠脚掌的创面后,能显著促进受损汗腺的修复与再生。人体移植试验表明,种植诱导的汗腺细胞后患者创面愈合部位呈现出汗功能,对照部位发汗试验阴性,形态学检测显示移植汗腺的真皮浅层有大量癌胚抗原(CEA)阳性细胞,结构类似正常汗腺组织。汗液成分分析结果显示移植处收集的汗液与正常皮肤处收集的汗液具有类似的pH值、渗透压和化学组分。第2例创面移植汗腺细胞后发汗试验也呈阳性。结论干细胞能够在体外成功诱导为汗腺细胞,移植后在创面能形成具有功能的汗腺。但在大面积烧伤患者早期切除焦痂后进行汗腺修复能否获此功效,尚待进一步研究。     

增生性瘢痕组织角质形成细胞中神经丝蛋白表达的特征及生物学意义

目的观察瘢痕组织与成人正常皮肤上皮细胞中神经丝蛋白(NFP)及其表皮细胞生长因子受体(EGFR)表达变化,阐明神经再支配对增生性瘢痕形成的影响.方法标本取自烧伤瘢痕愈合后11～26月来我院进行修复手术的病人,正常对照选自同一病人的供皮区.利用单克隆抗体免疫组织化学染色技术,光镜下观察瘢痕组织及正常皮肤上皮细胞中NFP和EGFR阳性细胞表达情况.结果瘢痕组织与正常皮肤上皮中神经丝蛋白与表皮细胞生长因子受体的表达存在差异,随着瘢痕的成熟,神经丝抗体的表达逐渐增强,而瘢痕早期表皮细胞生长因子受体的表达较强,瘢痕后期的表达减弱.结论增生性瘢痕与正常的皮肤中NFP的变化与EGFR活性与创面愈合的结局密切相关.神经调节在瘢痕形成的过程中可能充当了重要的角色.     

猪真皮与自体皮联合移植的实验研究

目的:本文观察了猪真皮与自体皮联合移植的效果.方法:20只Wistar鼠,背部切出全层皮肤.分别于移植真皮后当天、7天和10天再移植自体皮,打孔真皮组当天移植自体皮.通过测定创面面积和观察猪真皮与自体皮生长情况来评价创面愈合效果.结果:移植自体皮两周,自体皮与真皮牢固粘附和自体皮边缘生长扩展明显.3周,在打孔真皮上移植自体皮的创面已全部愈合,而其它3组仍残存小创面.4周移植自体皮与真皮以及创面周围组织相互融和,但自体皮与真皮之间仍存明显的分界线.各组创面面积保持在原创面的51.8%～66.9%.结论:结果提示自体皮在真皮上的移植时间和方式对创面收缩和愈合有影响.     

抑制原癌基因c-fos表达对创伤修复结局的影响

目的:探讨原癌基因c-fos在伤后皮肤创面愈合过程中的调控作用及其对修复结局的影响.方法:利用大鼠深Ⅱ°烫伤模型,采用免疫组化和原位杂交方法分别检测PCNA蛋白及bFGF mRNA在创面组织中的表达,并观察外源性使用c-fos单克隆抗体及bFGF后二者表达的变化规律及修复结局的改变.结果:烧伤诱导c-fos及bFGF mRNA的表达,从而启动修复过程.外源性应用c-fos抗体后,伤后各时间点基本探测不到bFGFmRNA的表达,伤后14d创面皮肤虽然基本完成了再上皮化过程,但其基底细胞排列成薄层细胞,PCNA数密度明显低于对照组,同时皮肤全层变薄.而创面外源性应用bFGF后,bFGF mRNA表达有一定增加,但无明显差异.但伤后14d创面皮肤组织基底层变厚,其中含有大量PCNA阳性细胞,真皮层亦变厚,并含有大量的毛细血管.结论:c-fos在创面愈合过程中具有重要作用,它可以启动bFGF基因转录,增加细胞的增殖活性.用c-fos抗体中和内源性c-fos作用可以明显抑制生长相关基因的表达,最后导致创面修复细胞PCNA表达下降.     

胎儿和成人皮肤中bFGF,c-fos和c-myc基因转录和翻译的变化及其与创面无瘢愈合的关系

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和癌基因c-fos、c-myc在胎儿和成人皮肤细胞内转录和翻译的变化规律及其对胎儿伤口无瘢愈合的影响.方法16例被测标本中包括不同胎龄的胎儿皮肤和成人皮肤组织各8例.用逆转录-多聚酶链反应方法(RT-PCR)检测这三种基因在不同的组织细胞内的表达变化规律,用免疫组化方法和常规病理技术确定这三种蛋白在胎儿和成人皮肤组织中的定位和表达量.结果在胎儿皮肤组织中,bFGF和c-myc两种基因都有表达,而c-fos基因的mRNA含量很低;随着胎儿的生长发育,三种基因的翻译水平逐渐增大,bFGF蛋白主要分布于表皮细胞和血管内皮细胞的胞浆和胞外基质中,而C-fos和C-myc的阳性颗粒主要存在于表皮基底层细胞中.在成人皮肤组织中,与胎儿相比,这三种基因的mRNA量都明显升高,蛋白水平也显著增大,而三种蛋白的分布没有明显变化.结论在成人皮肤组织内,bFGF、c-fos和c-myc三种基因转录和翻译的增强可能与伤口愈合形成瘢痕相关,而胎儿皮肤中这三种基因的mRNA和蛋白含量的降低可能是胎儿创面无瘢愈合的机制之一.     

表皮细胞去分化的初步实验研究

目的:进一步研究表皮细胞去分化,为创伤修复提供治疗途径。方法:包皮皮片去除脂肪细胞后,用蛋白水解酶消化分离表皮,分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘连并冲洗以去除表皮干细胞。处理后的表皮片用DAPI标记后移植到全层皮肤缺损的BALB/c裸鼠,并局部应用重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),7d后用免疫组织化学法和流式细胞仪法检测移植存活皮片的表型改变。结果:用Ⅳ型胶原反复粘连并冲洗的包皮皮片CK19和β1整合素染色阴性;移植后7d,部分皮片柔软、红润,部分皮片干硬呈黑色,皮片存活率为58·3%;存活皮片CK19和β1整合素染色呈多层分布,而不是正常表皮中的单层分布;流式细胞仪检测结果示:处理后的包皮皮片(移植前)α6 CD71-细胞占0·02%,α6 CD71 占0·03%;移植后7dα6 CD71-细胞占1·43%,α6 CD71 占2·82%,移植前与移植后α6 CD71-和α6 CD71 细胞比例有显著差异(P<0·05)。结论:细胞去分化参与创伤组织的修复,去分化源性干细胞可能成为一个新的干细胞来源。     

烧伤大鼠血清对不同来源间质干细胞的趋化作用

目的了解间质干细胞(MSC)的来源,观察烧伤大鼠血清对不同来源 MSC 的趋化作用。方法将72只大鼠采用完全随机法分成烧伤组(36只,制作背部30%TBSAⅢ度烧伤模型)、假伤组(36只,37℃模拟致伤)。从两组大鼠骨髓、外周血中分离并培养 MSC,在倒置显微镜下观察各组 MSC 的阳性率,比较其生长速度和细胞形态。同时观察不同血清对 MSC 的趋化作用及不同来源 MSC 的迁移能力。结果两组大鼠的骨髓内均培养出贴壁生长的 MSC。烧伤组12只大鼠外周血中有7只培养出 MSC,其阳性率(58%)明显低于骨髓培养(100%,P<0.05)。假伤组大鼠的外周血内未见 MSC(P<0.05)。倒置显微镜下可见原代接种后24h 有少量贴壁细胞,2～3d 后见其生长,散在贴壁,大多呈梭形。各组 MSC 形态无明显差异,均呈纺锤形生长。烧伤大鼠血清处理的假伤组骨髓 MSC 的迁移数[(94±11)个/高倍视野]明显多于正常大鼠血清和胎牛血清处理者[(37±6)、(38±11)个/高倍视野,P<0.01],后两者处理的 MSC 迁移数相近(P>0.05)。假伤组大鼠骨髓MSC 被不同血清趋化时迁移的细胞数明显少于烧伤组大鼠骨髓和外周血 MSC(P<0.05或0.01)。烧伤组大鼠骨髓 MSC 与外周血 MSC 的迁移能力虽有差异,但无统计学意义(P>0.05)。结论烧伤大鼠骨髓及外周血均能分离到 MSC,而正常大鼠仅骨髓能分离到 MSC。烧伤大鼠血清对 MSC 有较强的趋化作用。烧伤大鼠来源的 MSC 比正常大鼠来源的 MSC 具有更强的迁移能力。     

瘢痕组织中α-平滑肌肌动蛋白的表达与细胞凋亡的关系

目的:观察α-平滑肌肌动蛋白在瘢痕组织中的表达,了解病理性瘢痕形成过程中凋亡所扮演的角色及其与肌成纤维细胞在真皮中变化的关系。方法:瘢痕标本来自烧伤后来我院进行整形手术的病人,同时取病人手术供皮区的正常皮肤作为对照。 8例瘢痕组织标本 (含 2例愈合较为平坦的瘢痕和 6例增生性瘢痕组织)被分成增殖期和成熟期两组。运用caspase-3mRNA及其蛋白的表达及TUNEL方法检测瘢痕及正常组织中的凋亡细胞,并以免疫组化法检测瘢痕及正常皮肤真皮内α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体的表达。结果:瘢痕组织中细胞凋亡的数目与正常组织明显不同。瘢痕内的TUNEL标记阳性细胞数多于正常组织;增殖期瘢痕内的细胞凋亡的数目多于成熟期。增殖期TUNEL标记阳性的细胞多于平坦瘢痕,而成熟期两者无显著差别,Caspase-3mRNA及其蛋白的表达与TUNEL标记结果具有一致性。随着瘢痕组织的成熟,α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体的表达逐渐降低,平坦的瘢痕组织中的表现尤为明显;增生性瘢痕中,增殖期与成熟期之间无显著差别。结论:正常伤口愈合过程中,肌成纤维细胞暂时性的表达,可引起伤口的收缩,随着真皮再塑形,含有α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞因凋亡而消失,而病理性的愈合结局可能是它持续表达的结果。