肠球菌API、VITEK 2、23SrRNA鉴定结果的比较与分析

随着分子生物学技术的发展,核酸分析在细菌鉴定中已得到广泛应用.我们于2004年4月至2005年1月采用API、VITEK 2、23SrRNA PCR方法对临床分离的11株肠球菌的鉴定结果进行比较,旨在探讨不同的细菌鉴定方法在细菌分类学上的价值和应用,报告如下.     

青蒿琥酯在细胞水平抑制登革病毒的研究北大核心CSCD

目的研究青蒿琥酯在细胞水平抑制Ⅱ型登革病毒(DENV-Ⅱ)复制的效应。方法通过CCK-8法测定青蒿琥酯和利巴韦林对HepG2细胞的最大无毒剂量;通过空斑法、蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测评价青蒿琥酯抑制DENV-Ⅱ复制效应。结果 CCK-8试验测定青蒿琥酯和利巴韦林对HepG2细胞的最大无毒剂量分别为30μmol/L和50μmol/L。空斑试验显示青蒿琥酯能抑制DENV-Ⅱ粒子的释放(F=20.07,P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示青蒿琥酯和利巴韦林均能抑制DENV-ⅡRNA的复制(F值分别为9.928和107.2,均P<0.05),qPCR评价其半数有效抑制浓度(EC50)分别为28.89μmol/L和20.61μmol/L。蛋白免疫印迹试验显示青蒿琥酯能抑制DENV-Ⅱ包膜蛋白E的表达(F=24.23,P<0.05)。检测不同时间点给药,实时荧光定量PCR结果显示在病毒感染2 h后给药有抑制DENV-Ⅱ病毒复制效应(F=3.621,P<0.05)。结论青蒿琥酯能从细胞水平上抑制DENV-Ⅱ病毒的复制。     

黄芪miRNA的预测及其干旱表达模式分析

目的利用生物信息学手段预测黄芪Astragalus membranaceus的miRNA及其靶基因,应用定量PCR分析其干旱胁迫表达模式,为黄芪miRNA研究奠定基础。方法下载公共核酸数据库中的黄芪高通量测序序列,使用Trinity软件拼接获得转录本数据。利用生物信息学预测方法进行黄芪miRNA及其靶基因的预测,并对靶基因进行功能分类分析。利用茎环引物荧光定量PCR方法验证miRNA的存在,并分析miRNA在干旱胁迫下的表达模式。结果序列拼接获得88 263条黄芪转录组数据。使用这些数据预测到分属于17个家族的17个miRNA序列以及相应的茎环结构前体。这些miRNA靶向的145个基因主要参与基因转录调控、物质代谢、信号转导、胁迫应答和蛋白翻译后修饰等生物学过程。随机选取8个miRNA进行茎环引物荧光定量PCR验证,其干旱逆境表达模式分析表明miR2118和miR166可能参与了黄芪的干旱胁迫应答。结论预测的黄芪miRNA、靶基因以及干旱应答miRNA,为理解miRNA在黄芪中的生物学功能提供了重要数据。     

厚朴转录组SSR标记的开发及功能分析

目的分析厚朴转录组中的SSR位点,并设计引物初步验证,对含SSR的序列进行功能分析,为厚朴分子辅助标记育种和资源保护提供了有利工具。方法将通过厚朴高通量转录组测序获得的Unigene序列进行SSR位点挖掘,利用Primer.03进行引物设计,随机挑选45对引物进行PCR,并利用Blast软件对含有SSR的Unigene进行功能分析。结果在16 369条厚朴转录组序列中共获得8 635个SSR位点,出现频率为52.75%。SSR序列中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,重复比例最高为10次,主导重复基元类型为A/T(47.16%)、AG/CT(31.74%)、AAG/CTT(6.53%)。45对引物中22对(48.89%)可以扩增出预期大小的条带。含SSR的Unigene与能量和氧化还原等代谢过程,以及RNA转运、剪接体和植物激素信号转导等通路有关。结论厚朴高通量转录组序列的SSR位点具有类型丰富、特异性强和潜能高等特点,同时SSR序列的功能分析将为厚朴基因挖掘和分子标记辅助育种提供有利的工具。     

基于单细胞测序及蛋白质组数据分析尿酸转运蛋白在肾脏的精细表达定位

目的利用单细胞测序、微量蛋白质组学及免疫组化三部分数据深入分析肾脏尿酸转运蛋白的细胞分布及表达丰度。 方法利用2个成人健康肾脏的单细胞测序数据集(GSE131685)分析12个肾脏尿酸转运基因的细胞定位及表达丰度,进一步利用激光微切割联合质谱检测大鼠肾小管14个区段蛋白质数据集12个蛋白的定位和丰度,最后利用ProteinAtlas数据库检索上述蛋白在肾脏中的免疫组化染色结果。 结果单细胞测序数据集GSE131685中,12个尿酸转运蛋白集中表达于近端小管细胞,而在KIT数据集中,除了ABCG2、SLC22A12和SLC22A13外,其余都集中表达于近端肾小管S1,S2和S3段细胞。KEAT蛋白数据集的分析结果与KIT数据结果类似：ABCG2,SLC17A3,SLC22A12,SLC22A6和SLC22A8在近端小管S1,S2和S3段有显著的表达,尤其是SLC22A6仅富集在S2段肾小管,而ABCG2在S3段有较强的富集,其它的蛋白表达丰度相对较低。ProteinAtlas的免疫组化数据显示出与单细胞测序及蛋白质组的结果有较大的差异：ABCC2、SLC17A4、SLC22A6、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13及SLC2A9显示在近端小管比较特异的表达定位,其中ABCC2、SLC22A6、SLC22A11和SLC22A13信号较强。ABCC4、ABCG2和SLC16A9的表达丰度相对较低,特异性较差。 结论尿酸转运蛋白在肾脏主要集中表达于小管的S1,S2和S3段细胞,蛋白质组数据和单细胞测序数据比较接近。单细胞测序及微切割的微量蛋白组学是研究蛋白精细定位的良好工具。本研究为今后研究尿酸转运蛋白的功能及研发降尿酸药物提供基础依据。     

高灵敏度乙肝核酸定量与乙肝血清标志物的相关性分析

目的 探讨高灵敏度的荧光定量PCR检测的乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)与乙肝血清免疫标志物(HBV M)之间的相关性及临床意义.方法 选取234例患者标本,同时检测HBV DNA载量和HBV M.根据HBV M模式将结果分为五组,并对HBV DNA载量和HBV M之间的关系进行分析.选取177例乙肝患者,分析HBV DNA载量水平与HBeAg之间的关系.结果 Ⅰ组HBV DNA阳性率为77.4％;Ⅱ组HBV DNA阳性率为70.4％,两者之间差异无统计学意义(χ2=0.617,P ＞0.05).HBeAg表达水平与HBV DNA载量之间存在正相关关系(γ=0.812,P＜0.01).结论 高灵敏度HBVDNA与经典化学发光法的检测结果之间有很好的相关性.提高HBV DNA的检测灵敏度对于乙型肝炎患者,尤其对小三阳患者的病情和疗效评估具有重要的临床意义.     

戊型肝炎病毒衣壳蛋白特异性人源单克隆抗体的筛选与鉴定

目的:建立从外周血快速筛选戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)衣壳蛋白特异性人源抗体的方法,从疫苗免疫者外周血中筛选出相应抗体并进行鉴定。方法:采用分选型流式细胞仪获得外周血中HEV 衣壳蛋白特异性的记忆B细胞,通过单细胞RT-PCR 的方法获得抗体序列,并进行重组表达,最后对获得的人源单克隆抗体进行初步性质鉴定。结果:成功筛选到识别HEV 衣壳蛋白的6 株人源单克隆抗体,6 株抗体均具有抗原结合活性,4 株抗体具有中和活性。结论:成功获得HEV 衣壳蛋白特异性人源单克隆抗体序列,并进行真核表达,对抗体的性质进行初步鉴定,为后期研究疫苗免疫的人体内的抗体演化打下基础。     

高转移肺癌细胞株95 D中特异表达的C3orf1基因分析

目的 进一步了解肺癌转移的分子机制,筛选高转移肺癌中差异表达的基因。方法 利用荧光差异显示技术（DD—PCR）获得差异片段,对这些片段进行克隆和序列分析。通过在GenBank中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因。利用定量PCR检测验证该基因表达的差异性,并对该基因的结构进行预测。结果 通过DD—PCR得到9个差异片段,其中一个片段对应于C3orf1基因。定量PCR验证的结果表明,C3orf1基因在高转移肺癌中的表达量显著高于其他被测试的5种肿瘤细胞。该基因的读码框长858bp,编码285个氨基酸,分子量约32200。蛋白质结构预测分析发现,该基因含有7个类似表皮生长信号区,N端有一含有24个氨基酸的信号肽,并且还可能有3个2S-2Fe铁氧化还原蛋白铁硫结合信号区,2个维持自身静态平衡的VWFC信号区和2个硫解酶活性区。结论 C3orf1基因在高转移肺癌中异常表达,可能是分泌型的生长因子类蛋白,刺激细胞的生长。     

实时定量PCR在干细胞及肿瘤研究中的应用

实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已广泛用于生物医学及临床医学等多个领域。而在干细胞研究和肿瘤诊断的研究中,国内外文献报道较少,本文就其中方法原理、研究进展及其在干细胞和肿瘤研究方面的应用作一简要综述。     

自身猝灭探针定量PCR检测HCV方法的建立

目的 建立自身猝灭荧光探针定量PCR技术检测HCV方法.方法 构建重组质粒pMD18-T-HCV5'NCR作为标准品,并通过Sigma在线软件设计自身猝灭探针,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.结果 建立了自身猝灭荧光探针的定量PCR方法,线性为101～1010copies/μl;灵敏度达50 copies/μl;批内CV为6.1%,批间CV为6.5%,日间CV为6.8%;特异性为100%,与其他肝炎病毒无交叉反应.与紫外定量方法比较,结果差异无显著性,且高度相关.结论 以自身猝灭荧光探针建立的HCV荧光定量PCR检测方法,灵敏度高、特异性强,为新型试剂盒的开发奠定了基础.