KLF4、KLF6在人膀胱移行上皮癌组织中的表达及临床意义

目的:观察KLF4、KLF6在人膀胱移行上皮癌组织中的表达,并探讨其对膀胱癌发生、发展的影响。方法:采用实时定量荧光PCR技术检测49例膀胱癌手术切除标本癌组织与25例正常膀胱上皮组织内KLF4、KLF6mRNA的表达,并分析其与患者临床病理特征的关系,采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果:实时定量荧光PCR结果显示KLF4在膀胱移行上皮癌组织中的相对含量为(0.218±0.046),在膀胱正常上皮组织中的相对含量为(0.311±0.056),二者之间差异有统计学意义(P0.05)。KLF6在膀胱移行上皮癌组织中的相对含量为(0.198±0.038),在膀胱正常上皮组织中的相对含量为(0.285±0.043),差异有统计学意义(P0.05)。膀胱移行上皮癌组织中,KLF4与肿瘤的组织学分级、TNM分期及有无淋巴结转移有关(P0.05),与患者的性别、年龄无关(P0.05);而KLF6表达与肿瘤的TNM分期有关(P0.05),与肿瘤组织学分级、淋巴结转移及患者的年龄性别均无关(P0.05)。结论:KLF4和KLF6表达降低可能与膀胱移行上皮癌的发生和浸润密切相关,通过干预KLF4和KLF6的活性可能成为治疗膀胱移行上皮癌的新靶点。     

HpaⅡ—PCR检测急性白血病降钙素基因高度甲基化

应用聚合酶链反应(PCR)结合HpaⅡ限制性内切酶消化法(HpaⅡ—PCR)检测78例急性白血病(AL)患者降钙素(CT)基因的甲基化快态。病例组待检细胞DNA经 HpaⅡ消化后,再用两对CT基因特异性引物作 PCR扩增,分别产生长度为 566 bp和1.4 kb特异片段。急性淋巴细胞白血病阳性率 68.8％(33/48),急性非淋巴细胞白血病73.3％(22/30),敏感性达10~(-3)。证明CT基因5’高度甲基化是白血病细胞克隆的特异标志。本方法对恶性血液病的诊断治疗及其微小残留病(MRD)的检测都具有重要意义。     

二次PCR在临床上的应用

对临床待检标本进行二次ＰＣＲ扩增，结果显示：使用不同厂家的试剂盒进行二次ＰＣＲ扩增，敏感度均主于第一次扩增效果，尤其对于含靶基因少的标本，如检测脑脊液、血液听结核杆菌，慢性淋病奈瑟氏菌感染的患者，其阳性率均是第一次ＰＣＲ放增结果的２．３３、３倍，并且特异性不受影响。     

猪链球菌2型毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患传染病，该病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重要疫病，同时也是公共卫生防疫的重点。不同猪链球菌2型菌株的致病力不同，可分为高致病性毒株、低致病性毒株、不致病性毒株3种，这种致病力差异与各菌株的毒力因子直接相关，猪链球菌的毒力因子较为复杂，已知的毒力因子有溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外蛋白因子（EF）、溶血素（SLY）、荚膜多糖（CPS）、     

荧光PCR检测HPV在宫颈病变诊断中的临床意义

人类乳头瘤病毒(HPV)是一种双链闭和环状DNA病毒,对人类黏膜上皮细胞具有特嗜性,感染后可导致多种上皮细胞良、恶性增殖性疾病。目前,根据基因片段多态性已鉴定出200余型HPV,依据其致病力的强弱又分为低危险组和高危     

重庆地区不同育龄围产期女性B族溶血性链球菌的研究

目的探讨该地区不同育龄女性围产期B族溶血性链球菌(GBS)感染情况。方法采用聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术,对该院2015年1月至2016年1月3 206例标本进行GBS核酸检测。结果 GBS阳性标本226例,阴性2 980例,感染率为7.05%,20~25岁组为6.88%,26~30岁组为6.51%,31~35岁组为7.50%,36~40岁组为11.46%,40岁以上组为11.11%,其中30~40岁组感染率最高。不同组别之间两两比较,差异无统计学意义(P0.05)。该地区育龄女性与北京、南京、上海等地区比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论对该地区34~37周围产期女性开展GBS筛查,降低感染率,为围产期保健提供临床价值。     

再生障碍性贫血患者环孢亲和素mRNA表达与环孢菌素A疗效的关系

目前认为，免疫介导的造血抑制是再生障碍性贫血（AA）重要的发病机制之一。环孢菌素A（CsA）作为一种强烈的特异性免疫抑制剂，已广泛用于各型AA的治疗。但不同个体对CsA的反应存在显著差异。环孢亲和素（Cyclophilin，CyP）是CsA的细胞内受体。我们采用半定量RT—PCR法检测AA患者CyPmRNA表达水平，探讨其与CsA临床疗效的相关性，以期进一步了解CsA治疗AA的机制和阐明免疫发病机制，为AA的个体化治疗提供理论依据。     

应用实时RT-PCR技术的mRNA定量分析

1　ｍＲＮＡ定量的意义特定基因的表达水平可反映细胞的生长、存活状态 ,对特定基因转录水平的定量分析已成为基因功能研究的核心部分[1] 。最近 ,分子生物学技术的飞速发展使得ｍＲＮＡ定量分析用于临床诊断成为现实 ,其应用涉及面很广 ,包括检测肿瘤细胞耐药基因的调节与表达、化疗疗效的分析、基因治疗的生物动力学与转录、表达水平的研究 ;并提供了评价肿瘤进展 ,检测外周血中肿瘤细胞的有效手段 ;此外 ,ＲＮＡ定量分析还可用于病菌、病毒的检测[2～ 6 ] 。通常用于ｍＲＮＡ定量分析的方法有 :①Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交、原位杂交 +后续…     

检测HPV的新策略—简并引物PCR

目前用ＰＣＲ法检测ＨＰＶ多采用型特异性引物，该法有很多弊端。最近人们采用简并引物ＰＣＲ法来检测ＨＰＶ，即借助一对ＨＰＶ简并引物用ＰＣＲ技术扩增ＨＰＶｓ ＤＮＡ，进而用分子杂交法或用酶切片段长度多形性来确定ＨＰＶ类型，该法较型特异性引物ＰＣＲ有很大优点。本文就ＨＰＶ简并引物的设计、ＨＰＶ类型确定方法等进行了详述。     

血管内皮细胞生长因子受体KDR基因靶向RNA干扰质粒的构建

目的:应用RNA干扰技术设计构建针对血管内皮细胞生长因子受体KDR的小干扰RNA,并观察脂质体转染肺癌细胞A549后的干扰效果。方法:实验于2005-03/2006-01在沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室完成。①设计针对KDR编码区有短发夹结构的3条mRNA序列,经退火成互补双链,克隆到pGCsi.H1/neo/GFP载体中构建3个重组质粒,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3。②设立5组:小干扰RNA组,分别转染KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3;阳性对照组,转染pGCsi.H1/neo/siGFP,该质粒载体中的插入序列为针对绿色荧光蛋白的小干扰RNA,不干扰待研究的内源性基因;阴性对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP/NON,该载体为不干扰任何内源性基因的小干扰RNA;空白对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP空载体;正常对照组,不进行任何转染。③对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析;脂质体法转染质粒至肺癌A549细胞株后,实时定量PCR检测KDRmRNA的水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果:①小干扰RNA表达载体的鉴定:KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3表达载体用限制性内切酶NdeⅠ和SmaⅠ进行单酶切后,均产生约713bp、5480bp和2403bp、3790bp两个片段,与预期结果相同。测序结果与设计的编码相应短发夹状KDR-小干扰RNA的寡核苷酸序列一致,证明KDR-小干扰RNA真核表达载体构建成功。②KDR-小干扰RNA对A549细胞中KDRmRNA水平的影响:与阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和正常对照组的A549细胞相比,KDR-siRNA1,2,3表达载体转染后的A549细胞KDR基因表达水平均明显受到抑制,抑制率分别为64%、81%和72%,其中以KDR-siRNA2抑制作用最为明显。③KDR-小干扰RNA对A549细胞生长的影响:阳性对照组、阴性对照组、空白对照组、正常对照组的A549细胞生长趋势较为一致,且生长速度均明显高于转染3种KDR-小干扰RNA表达载体的A549细胞,从接种第2天开始差异有显著性意义(t=15.29～17.65,P均<0.01)。结论:血管内皮细胞生长因子受体KDR靶向RNA干扰重组质粒构建成功,该载体能有效抑制肺癌A549细胞KDR基因表达与细胞增殖。