Tca-8113细胞系单细胞体外增殖的实验观察

目的:观察舌鳞癌Tca-8113细胞系的单细胞体外增殖能力,寻找肿瘤干细胞存在的依据,从而为鉴定其表面标记物奠定理论基础。方法:采用有限稀释法对舌鳞癌Tca-8113细胞进行单细胞体外培养,了解舌鳞癌细胞(Tca-8113)的分裂、增殖特点。结果:单细胞培养8d后,舌鳞癌Tca-8113细胞株中具有持续增殖能力的细胞占肿瘤细胞的10.85%,12d后,继续分裂增殖的细胞比例为5.23%,16d后,仅有5.09%的细胞继续增殖。结论:舌鳞癌Tca-8113细胞具有异质性,仅有少量细胞具有持续增殖能力,而这部分细胞是否就是舌鳞癌Tca-8113细胞的肿瘤干细胞。还有待进一步的实验研究证实。     

PD-L1mRNA与PD-L2mRNA在口腔扁平苔藓中的表达特点及可能作用

目的:研究PD-L1mRNA、PD-L2mRNA在口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)患者外周血与损害组织,以及在不同临床类型与病理分型中的表达特点。方法:采用实时定量PCR方法检测60例OLP患者(斑纹型35例,充血糜烂型25例;不伴异常增生38例,伴轻度异常增生22例)PD-L1mRNA、PD-L2mRNA表达水平,并以10名正常人外周血与黏膜组织作为对照,比较不同临床类型和病理类型OLP患者间PD-L1mRNA、PD-L2mRNA表达水平差异,并分析PD-L1mRNA、PD-L2mRNA在OLP患者外周血与损害组织中表达的相关性。利用SAS6.12软件包中的非配对两样本均数比较的Wilcoxon秩和检验,比较不同组别间的差异。结果:PD-L2mRNA在OLP患者外周血中表达降低,损害组织中表达升高,且在不同临床类型OLP患者之间存在显著差异(P<0.05)。PD-L1mRNA在OLP组与正常对照组之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PD-L2分子可能在OLP患者全身与损害局部对OLP的发生、发展产生不同的影响。     

轻重症及转归阶段的COVID-19患者免疫细胞的单细胞转录谱分析

 目的 构建轻重症及转归阶段的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019,COVID-19）患者和健康对照的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的单细胞转录图谱,分析疾病进展及恢复与宿主免疫反应之间的关系。方法 从公共数据库中获取健康对照和COVID-19重症、轻症、恢复早期、恢复晚期患者PBMCs的单细胞转录组（single-cell RNA sequence,scRNA-seq）测序数据,根据每个细胞的表达谱将细胞进行聚类后,根据已知的细胞标志物确定每个聚类的细胞亚型,统计并比较每个细胞亚型的比例,并对轻重症及转归阶段细胞的差异表达基因进行分析。结果 控制数据质量后得到的115 334个PBMCs分成22个细胞亚群。CD14+单核细胞、炎症性单核细胞、naïve B细胞和中间记忆B细胞在重症患者PBMCs中明显升高;增殖性CD8+ T/NK细胞在重症患者T细胞中的比例明显升高;XCL1+ NK细胞在重症患者PBMCs中明显降低;cDC2细胞、pDC细胞在恢复期患者PBMCs中明显升高。随着疾病的缓解与康复,PBMCs中NK细胞的比例逐步升高。疾病期与康复期的PBMCs中与白细胞活化、白细胞黏附相关的基因均有上调。结论 轻重症及转归阶段的COVID-19患者PBMCs在细胞比例和表达谱上变化较大。     

采用重叠PCR构建高灵敏度酵母细胞传感器评估遗传毒性化合物

采用重叠PCR（overlap PCR）方法构建了pdr5与snq2基因敲除组件,研究了pdr5、snq2基因突变对酵母细胞传感器评估遗传毒性的影响。考察了野生型、pdr5单基因突变、snq2单基因突变与pdr5、snq2双基因突变酵母细胞传感器暴露于系列浓度甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、顺铂、4-硝基喹啉-N-氧化物（4NOQ）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、羟基脲、水杨酸和葡萄糖溶液24 h后的细胞生长抑制情况与16 h后的荧光诱导情况。研究结果表明,overlap PCR方法能够高效率构建基因突变酵母细胞传感器;snq2单基因突变与pdr5、snq2双基因突变细胞传感器检测遗传毒性的准确度为100%,高于野生型与pdr5单基因突变细胞传感器（87.5%）;pdr5、snq2双基因突变酵母细胞传感器表现出最高的遗传毒性检测灵敏度,为构建高准确度与灵敏度的酵母细胞传感器提供了思路与方法,为酵母细胞膜转运蛋白基因pdr5与snq2的进一步功能研究奠定了基础。     

一起由肠道侵袭性大肠埃希菌引起的食物中毒实验室分析

目的对食物中毒事件所采集的样品进行检测,查明本次中毒事件的致病因子,对后续治疗和预防控制工作提供实验室支持。方法运用实时荧光PCR和传统细菌分离鉴定两种方法对可疑食物中毒样品进行微生物检验。结果实时荧光PCR和血清凝集实验显示,此次事件的病原菌疑似志贺菌,生化鉴定为大肠埃希菌;菌株送上级疾控中心进行复检,经生化鉴定和致泻大肠埃希菌PCR确认试验,确定该事件病原菌为肠侵袭性大肠埃希菌。结论此次事件是一起由肠侵袭性大肠埃希菌引发的食物中毒事件,因志贺菌PCR试剂盒特异性不足、致泻大肠埃希菌和志贺菌存在血清交叉凝集等,导致本次检测没能及时得出正确结论。在食物中毒检验中,细菌学分离和鉴定是细菌检验定性的金标准,当其他检验方法结果与之矛盾时,应以生化反应结果为判定标准。     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。     

高通量测序技术检测非小细胞肺癌相关驱动基因的突变

目的：探讨高通量测序技术在非小细胞肺癌驱动基因检测中的应用。方法：应用 Ion Torrent 高通量测序平台,检测150例非小细胞肺癌（non?small?cell lung cancer,NSCLC）患者EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her?2和PIK3CA基因突变,并利用Sanger 测序法和微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）法检测150例NSCLC患者EGFR基因突变,对结果进行对比分析。结果：EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her?2和PIK3CA基因突变检出率分别为51.33%（77/150）、7.33%（11/150）、1.33%（2/150）、1.33%（2/150）、2.00%（3/150）和4.67%（7/150）。57例标本未检出任何基因突变,84例标本检出单个驱动基因发生突变。9例标本检出2个及以上驱动基因发生突变。Sanger测序法检测EGFR基因突变,突变检出率为38.67%（58/150）,与高通量测序法比较,差异有统计学意义（χ2=4.862,P=0.027）,高通量测序法的灵敏度为98.28%,特异度为78.26%。ddPCR法突变检出率为50.00%（75/150）,与高通量测序法比较,差异无统计学意义（χ2=0.053,P=0.818）,阳性一致率为82.67%,阴性一致率为80.00%,总一致率为81.33%。结论：高通量测序法更适合应用于NSCLC诊疗,Sanger测序法和ddPCR法可作为有益的补充。     

一起由金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌引发食物中毒病原分析

目的 通过一起疑似葡萄球菌引发食物中毒进行葡萄球菌肠毒素检测,并结合检测出致病性葡萄球菌病原学分析,为下一步食物中毒处置提供诊断依据。方法 根据流行病学调查和国家标准《食品微生物学检验》GB4789,对可疑食物及患者呕吐物、肛拭子等进行了几种常见致病原菌分离培养,并直接采用实时荧光PCR方法对金黄色葡萄球菌肠毒素A~E基因进行分型,用全自动微生物鉴定分析仪进行系统生化鉴定,并做血浆凝固酶试验。结果 在食用剩余汉堡中分离出1株金黄色葡萄球菌、2名患者肛拭子中分离出2株金黄色葡萄球菌,1名患者呕吐物中分离1株血浆凝固酶阴性路邓葡萄球菌,利用PCR方法分别对其进行了肠毒素基因分型,结果显示,食用剩余汉堡中1株和2株患者肛拭子的金黄色葡萄球菌肠毒素均为SEA型,为同一型;1株患者呕吐物的路邓葡萄球菌的肠毒素为SEC型。 结论 该起食物中毒主要是由金黄色葡萄球菌产生SEA型肠毒素所导致,血浆凝固阴性路邓葡萄球菌跟金黄色葡萄球菌一样,也能产生肠毒素同样具有致病性作用,提示路邓葡萄球菌不单纯只是人类皮肤共生菌,或许还跟金黄色葡萄球菌同样具有侵袭性、产肠毒素等致病性,在进行公共卫生流行调查诊断时不能被忽视。     

广东省揭阳市2016—2020年外环境禽流感病毒监测

目的 了解揭阳市外环境禽流感病毒动态分布情况和流行特点,评估人感染禽流感病毒的风险,为人禽流感防控提供科学依据。方法 按随机抽样的方法,对揭阳市2016—2020年5个县（市、区）禽类市场进行相关标本采集,用实时荧光定量（RT-PCR）对标本进行流感病毒A型检测,阳性标本再进行H5N6、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒核酸检测。结果 揭阳市2016—2020年共采集外环境标本1 798份,甲型流感病毒（FluA）阳性标本660份,阳性率为36.71%;其中H5N6、H7N9、H9N2亚型阳性率分别为1.61%、1.28%和21.91%。普宁市和惠来县的外环境禽流感病毒阳性率较高,分别为54.14%和51.43%。揭西县的外环境禽流感病毒阳性率最低,为4.84%。不同类型标本检测阳性率最高为清洗禽类污水（47.09%）。结论 揭阳市禽类市场外环境中存在H5N6、H7N9、H9N2及多种亚型混合的禽流感病毒污染,禽流感病毒流行区域较广,存在感染人的风险,应继续加强外环境禽流感实时监测和城乡禽类市场卫生监管。     

高转移肺癌细胞株95 D中特异表达的C3orf1基因分析

目的 进一步了解肺癌转移的分子机制,筛选高转移肺癌中差异表达的基因。方法 利用荧光差异显示技术（DD—PCR）获得差异片段,对这些片段进行克隆和序列分析。通过在GenBank中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因。利用定量PCR检测验证该基因表达的差异性,并对该基因的结构进行预测。结果 通过DD—PCR得到9个差异片段,其中一个片段对应于C3orf1基因。定量PCR验证的结果表明,C3orf1基因在高转移肺癌中的表达量显著高于其他被测试的5种肿瘤细胞。该基因的读码框长858bp,编码285个氨基酸,分子量约32200。蛋白质结构预测分析发现,该基因含有7个类似表皮生长信号区,N端有一含有24个氨基酸的信号肽,并且还可能有3个2S-2Fe铁氧化还原蛋白铁硫结合信号区,2个维持自身静态平衡的VWFC信号区和2个硫解酶活性区。结论 C3orf1基因在高转移肺癌中异常表达,可能是分泌型的生长因子类蛋白,刺激细胞的生长。