一种基于Red的在大肠杆菌中修饰染色体和BAC的新型重组工程系统

近5年来兴起了一种新型的基于λ-噬菌体Red重组系统的重组工程技术，它将缺陷型λ-噬菌体整合入大肠杆菌染色体上，使3种重组酶蛋白Exo、Beta和Galn的表达受到严格的调控。Red重组工程技术不受酶切位点的限制，只需用35-50bp长的同源臂就能得到很高的重组效率。运用这种技术能在大肠杆菌体内通过同源重组对大肠杆菌染色体、BAC质粒等复杂DNA片段上的基因进行突变、敲除、替换等修饰；此外可运用该技术中缺口修复的方法构建质粒。Red重组工程技术有远大的应用前景，将极大地推动功能基因组研究的进展。     

睡眠剥夺对机体免疫功能的影响

睡眠剥夺 ( sleep deprivation, SD ) 指因环境需要丧失了正常所需睡眠量的状态,短时 间SD一般不会产生明显的不良影响,而长时间SD(24h或更长时间维持清醒)显著影响脑力工 作能力,并显著影响机体的免疫功能,这些影响随SD时间的延长而增加.在特殊情况下 , 如航空、航海、救援、医疗以及长途运输等,特别是战时环境下,SD是十分常见的现象,因 此国外非常重视对于SD的研究,本文就SD所导致的免疫功能变化作一综述.     

血管紧张素转换酶基因多态性与高血压的关系

目的研究血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因I／D多态性的分布及其与高血压发病之间的关系。方法应用PCR方法对356例海军干休所离退休干部进行ACE I／D基因型检测，并分析比较。结果海军老干部高血压病组ACE Ⅱ和ID基因型显著低于对照组（P〈0．01），而DD基因型显著高于对照组（P〈0．01）。结论海军老干部ACE基因多态性与原发性高血压有关，DD基因型易患高血压。     

人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选

目的:PC1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C42中高表达。为了进一步研究PC1基因的功能及作用机制,构建C42细胞的cDNA文库,寻找与前列腺癌相关基因PC1相互作用的蛋白。方法:从前列腺癌细胞系C42中提取总RNA,进而分离poly(A)+RNA,用poly(A)+RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组。通过文库片段、线性化的pGADT7Rec和诱饵质粒pGBKT7PC1C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的pGADT7Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选。最后用Far Western印迹方法进一步从体外论证了PC1蛋白可与自身相互作用形成二聚体。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000bp。共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105。接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106。筛选到4个与PC1蛋白相互作用的阳性克隆。从体外证明了PC1蛋白可形成二聚体。结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于前列腺癌相关基因     

用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA

目的：用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变。方法：用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌，利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至Ⅳ基因长约2100bp的DNA序列，并用kil-N序列中含有的单一酶切位点Xho Ⅰ对混合质粒进行酶切，取酶切产物转化W3110感受态细胞，菌落PCR方法筛选重组阳性克隆。结果：在没有任何筛选标记的情况下，用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆。结论：该方法操作简单、精确，能够避免引入新突变。为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法。     

高压氧治疗对沙土鼠脑缺血再灌注海马CA1区神经元凋亡的影响

目的:观察高压氧 (HBO) 作用下沙土鼠脑缺血再灌注海马CA1区神经元凋亡的变化,探讨HBO对脑缺血再灌注损伤的疗效及其机制.方法:建立沙土鼠脑缺血后再灌注模型,用HBO治疗连续3 d后,应用H-E和TUNEL染色方法,观察海马CA1区神经元的凋亡情况.结果:两种方法均显示沙土鼠脑缺血再灌注3 d后海马CA1区大量神经元凋亡,HBO治疗组凋亡细胞数明显减少(P<0.01),并以0.25 ATA HBO治疗组为佳.结论:HBO治疗对海马神经元缺血性损伤有保护作用,能减少其凋亡,是HBO治疗脑缺血性损伤的疗效机制之一.     

成纤维细胞生长因子-2治疗冠心病的临床研究进展

实验研究证明成纤维细胞生长因子-2具有保护心肌细胞，改善心脏功能，诱导血管新生，促进侧支循环的作用。1998年以来，采用不同方法对严重冠心病182例给予成纤维细胞生长因子-2I期临床试验，结果表明，疗效良好，副作用能够耐受而且安全。它可能为不适于经皮穿刺冠脉成形术治疗的严重冠心病患者，提供一种疗效良好的心肌血管再生疗法。     

短暂性脑缺血发作概念的争议与演变

1短暂性脑缺血发作(TIA)的传统定义与争议1951年美国神经病学家Fisher首次将“暂时出现的神经定位体征”命名为“短暂性脑缺血发作(TIA)”[1],1965年第4次普林斯顿会议上定义TIA为:大脑局灶性或区域性缺血产生神经功能缺失症状,并在24h内症状完全消失[2],被称为TIA的24h定义,1975年美国脑血管病分类中采用该定义,因此24h定义逐渐被推广,1986年起我国也基本采用该定义:反复发作的脑局部血流一过性减少,使相应灌流区出现短暂的神经缺失症状,临床表现为发病急,持续时间短,一般持续5~30min,最多不超过24h,多无意识障碍,不遗留后遗症。1995…     

简便快速检测质粒DNA的方法 (一)可用于检测和筛选的快速法

细菌常常含有染色体外小的环状DNA遗传因子——质粒。它可以作为遗传工程中克隆的主要载体。它与某些细菌病原性有关,例如各种耐药性质粒,引起小儿腹泻和成年人旅游者腹泻的大肠杆菌肠毒素质粒,与金黄色葡萄球菌肠毒素B相关的质粒,引起猪、牛腹泻痢疾的K88、K99表面抗原质粒等等。因此无论在遗传工程技术,还是临床检验,都需要将质粒DNA检出,确定其大小,作为进一步的研究和分析。对于简便快速检测质粒DNA的方法已有一些报导,但有的并不简便。我们应用菌落溶解物法;直接从琼脂平板上挑取1—2个大菌落或少量菌苔裂解,进行琼脂糖凝胶电泳,检测的效果是满意的。     

PC-1基因功能研究:PC-1蛋白兔多克隆抗体制备的改进和应用

目的:获得高效价PC-1蛋白的兔多克隆抗体,用于PC-1功能的实验。方法:实验于2004-02/08在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。以纯化后的PC-1蛋白及其N端46个氨基酸与GST的融合蛋白(GST-PC-1和GST-PC-1-46)为抗原,通过一种经淋巴结注射、免疫家兔的改进的免疫方法制备兔多克隆抗体。应用ProteinA亲和层析纯化抗体。以酶联免疫吸附和Western-blot及免疫组化法鉴定所得抗体。结果:①2个兔多克隆抗体的效价分别为1∶12800和1∶51200。②PC-1在高恶性前列腺癌细胞C4-2中高表达,在低恶性前列腺癌细胞LNCaP中有少量表达。③经免疫组化染色后,含有PC-1蛋白的C4-2及LNCaP细胞均呈阳性反应,细胞质中可见明显着色,而空泡状的胞核则没有着色,提示PC-1蛋白主要分布在细胞浆中。结论:用一种改进的免疫方法,获得高效价的、可应用于酶联免疫吸附和Western-blot及免疫组化实验的PC-1蛋白兔多克隆抗体。