α_1(Ⅰ)型前胶原基因反义重组质粒对成纤维细胞的影响

目的　研究反义RNA对成纤维细胞胶原蛋白的调控作用 ,探讨基因治疗增生性瘢痕的可能性。方法　将α1 (Ⅰ )型前胶原基因片段反向克隆至非整合型哺乳动物表达载体pREP9的多克隆位点中 ,以构建α1 (Ⅰ )型前胶原基因反义RNA表达载体pREP9 AScoll,并籍脂质体 lipofectamine将其导入人胚肺HLF细胞中 ,运用MTT试验、电镜、3H 脯氨酸掺入法检测反义RNA表达载体对HLF细胞的影响。结果　外源重组体pREP9 AScoll对胶原蛋白的合成有明显抑制作用 ,但对细胞增殖无任何影响。结论　α1 (Ⅰ )型前胶原基因反义重组质粒能有效调控胶原蛋白的合成 ,从而有在基因水平防治瘢痕的前景。     

重组人表皮生长因子软膏对烧伤创面修复的促进作用

目的　探讨重组人表皮生长因子 (rh EGF)软膏治疗烧伤的有效浓度 ,并观察对创面愈合的促进作用。方法　将 12 0例烧伤患者分为两部分 ,第一部分选择 15例浅 °烧伤患者 ,采用开放实验 ,分三组每组 5例 ,进行三种不同浓度 rh EGF软膏 (0 .5 μg/ g,10 μg/ g,5 0 μg/ g)的疗效比较 ,确定临床使用浓度。第二部分 ,选择浅 °和深 °烧伤患者10 5例为试验对象 ,在第一部分研究的基础上选取最适药浓度 ,进行多中心随机双盲实验 ,所有患者均采用自身对照。以创面愈合为指标 ,判断创面愈合时间 ,并观察创面动态愈合率及不良反应。结果　第一部分患者 10 μg/ g和 5 0 μg/ g组的创面愈合时间差异不显著但较 0 .5 μg/ g组明显缩短 ,有统计学意义 (P<0 .0 1)。第二部分选用 10 μg/ g浓度的 rh EGF软膏与水溶性软膏基质进行随机双盲研究。浅 °创面用药组愈合时间为 (8.39± 2 .2 5 )天 ,空白对照组为 (9.5 2± 2 .5 6 )天 ,组间比较具有统计学意义 (P<0 .0 1) ;用药组不同时间内的愈合率较对照组明显提高 ;深 °创面愈合时间用药组、对照组分别为 (16 .80± 2 .99)天 ,(18.2 7± 3.17)天 ,组间比较有统计学意义 (P<0 .0 1)。结论　rh EGF软膏对烧伤创面有明显的促进修复作用 ,且 10 μg/ g的浓度较为理想     

靶向血管治疗增生性瘢痕的实验研究

目的 探讨靶向血管治疗烧伤后增生性瘢痕的可行性和方法。方法 通过建立增生性瘢痕的裸鼠移植模型，使用不同剂量血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，进行瘢痕内注射治疗，观察瘢痕Ⅰ型、Ⅲ型胶原和血管的量以及其超微结构的变化。结果 靶向血管治疗3周后，增生性瘢痕的体积明显减小，瘢痕胶原、血管明显减少，瘢痕内大量成纤维细胞坏死、凋亡，代之成熟的纤维细胞，失去了典型增生性瘢痕的特征。结论 血管内皮生长因子可能对增生性瘢痕中的大量血管新生起支持作用，大量血管对增生性瘢痕的胶原合成可能起着促进作用，针对VEGF的靶向血管治疗可能是治疗增生性瘢痕的的一种有意义的方法。     

磷酸化Smad2和Smad7在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达

Smads蛋白家族是近年来发现的转化生长因子（TGF）-β1受体下游信号蛋白，也是目前公认的介导TGF-β1胞内反应的主要通路。笔通过检测体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）和正常皮肤成纤维细胞（NSF）中磷酸化Smad2和抑制性信号介导子Smad7的表达差异，拟探讨二在增生性瘢痕发病机制中的作用。     

柑皮提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原代谢的作用

目的观察柑皮提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖以及胶原代谢的影响。方法人增生性瘢痕皮肤标本取自笔者单位行整形术的2例烧伤患者。采用组织块法培养成纤维细胞后分为:实验组,细胞加入成纤维细胞培养基与柑皮提取物,并根据提取物的浓度分为2．5、5．0、10．0、25．0 mg／L4个部分;空白对照组,细胞仅加入成纤维细胞培养基;对照组,细胞加入体积分数5％乙醇与成纤维细胞培养基。采用噻唑蓝比色分析法、原位缺口末端标记法及放射免疫法观察各组成纤维细胞增殖情况,计算增殖抑制率;计算凋亡指数(AI)以及检测Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(ICTP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)含量的变化。结果实验组2．5-25．0 mg／L柑皮提取物的细胞增殖抑制率分别为(7．100±0．038)％、(8．100±0．048)％、(10．900±0．055)％、(15．900±0．097)％; AI分别为69．7％、71．7％、86．4％、95．2％;ICTP分别为(17．2±0．6)、(18．3±0．6)、(19．8±0．5)、(23．2±0．6)μg／L;PINP分另0为(101．7±1．4)、(107．8±1．1)、(111．6±1．2)、(124．6±1．3)μg／L,均明显高于对照组(P<0．05)。空白对照组上述指标与对照组相近(P>0．05)。结论柑皮提取物能抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖,促进其凋亡及Ⅰ型胶原分解,具有治疗和预防增生性瘢痕的作用。     

转化生长因子β1对培养的瘢痕成纤维细胞挛缩功能的作用

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞诱导肌动蛋白(α-actin)和粘连蛋白(FN)表达的作用,探讨TGF-β1与烧伤瘢痕挛缩的关系.方法采用细胞培养、ELISA法、免疫组化、图像分析技术,观察在不同TGF-β1含量作用下,瘢痕成纤维细胞α-actin和FN表达的情况.结果不同含量TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-actin和FN的作用不同,以10～50 μg/L的TGF-β1作用最有效;与对照组相比,实验组的成纤维细胞表达更明显,差异均有显著性意义.结论TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞α-actin和FN的表达增加可能与烧伤瘢痕挛缩有关.     

深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中转化生长因子β表达及微血管生成和胶原合成与解毒烧伤膏的干预作用

目的:观察有一定促进浅Ⅱ度、深Ⅱ度创面愈合作用的解毒烧伤膏在烫伤创面愈合过程中对转化生长因子β、微血管生成和胶原合成的影响,探讨其可能的作用途径。方法:实验于2004-09/2004-12在中山大学动物中心和中山大学附属第一医院外科实验室完成。取10只小香猪,制作深Ⅱ度烫伤创面模型,随机分为解毒烧伤膏观察组和空白对照组,记录创面愈合时间;分别在伤后第3、5、7、9天取材,采用免疫组织化学链菌素生物素-过氧化物酶标记物法法检测转化生长因子β的表达,在400倍光镜下随机选取5个视野,每个视野观察100个细胞,以胞浆或(和)胞核着棕色者为阳性染色,计数阳性细胞数。以CD34一抗免疫组织化学标记血管内皮细胞,先后在低倍镜(10×10)下全面观察切片,以确定组织血管密度最高处,再在高倍镜(10×40)下计数并记录5个视野的微血管数,取其平均值,记数微血管密度。羟脯氨酸法检测每克组织胶原含量。比较实验组与对照组创面愈合时间,转化生长因子β的阳性表达率,创面微血管密度计数及胶原含量测定。结果:纳入动物10只,全部进入结果分析,无脱失值。①观察组烫伤愈合时间明显早于对照组[(11.0±1.5),(14.0±2.5)d,t=4.08,P<0.001]。②转化生长因子β表达主要在炎症细胞和毛囊上皮细胞,伤后第3、5天,观察组转化生长因子β的阳性表达率明显高于对照组[(25.0±7.5)%,(11.0±4.6)%;(45.7±8.3)%,(24.6±7.4)%,t=3.61,6.34,P<0.01];观察组转化生长因子β表达的高峰早于且强于对照组。③第5天微血管密度记数观察组显著高于对照组[(40.6±2.4),(32.6±2.4)个,t=2.69,P<0.05]。④观察组第7、9天胶原含量明显高于对照组[(2.45±0.72),(1.97±0.15)g/mg;(3.51±0.46),(2.85±0.13)g/mg;t=3.61,6.79,P<0.01]。结论:解毒烧伤膏能促进烫伤创面的愈合,可能与早期提高组织中转化生长因子β的表达、促进血管增生和后期胶原的合成有关。     

转化生长因子β与增生性瘢痕

深Ⅱ°以上的烧伤创面 ,外伤后延期愈合的创面均可伴不同程度的瘢痕增生和挛缩。增生性瘢痕 (ｈｙ ｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｓｃａｒ,ＨＳ)是临床上常见的皮肤纤维增生性疾病 ,严重影响深度烧伤患者的功能康复。目前的治疗方法主要是外科手术、加压、浅层放射、激素、中草药等 ,但效果均不甚满意[1] 。细胞和分子生物学研究显示 ,在组织修复过程中 ,有多种细胞因子参与调节。成纤维细胞 (ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ,ＦＢ)将Ⅰ型前胶原基因转录上调 ,Ⅰ型胶原蛋白合成增加 ,Ⅲ /Ⅰ胶原比例下降 ,导致细胞外基质 (ｅｘｔｒａｃｅｌ ｌｕａｒｍａｔｒ…     

正常人皮肤表皮干细胞定位特征对修复皮肤创伤的意义

目的：研究正常人皮肤中表皮干细胞的定位特征，探讨表皮干细胞与烧伤创面愈合的关系。方法：在需手术治疗的患者身上获取正常皮肤组织共24例，用α2、β1整合素和K10角蛋白作为第一抗体标记表皮干细胞，采用LSAB免疫组化方法研究皮肤中的表皮干细胞的表达位置。结果：分化高的K10阳性细胞分布于除表皮基底层以外的所有基底上层包括角质层、透明层、颗粒细胞层和棘细胞层的细胞中，而阴性染色区域则集中于表皮基底层。说明表皮基底层细胞不表达K10角蛋白；而α2、β1整合素阳性细胞位于基底膜上、邻接真皮的基底层，呈波浪状，起伏不平分布，同时在头皮的真皮网状层、毛囊末端底部及汗腺周围也发现有阳性细胞。而阴性染色细胞则位于基底层以上的表皮细胞。结论：表皮基底层、毛囊及汗腺周围中存在的表皮干细胞可能与皮肤创伤的修复有关，不同创面中残存的表皮干细胞可能是创伤修复过程中再上皮分化的细胞来源，这提示对残存的表皮干细胞的保护、激活、促进其增殖和分化是研究促进创面愈合的关键，从而可以部分阐明创伤愈合的机制。     

人增生性瘢痕成纤维细胞最佳转染条件：α1（Ⅰ）型前胶原基因反义寡核苷酸转染的实验

目的：选择α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡核苷酸转染人增生性瘢痕成纤维细胞的最佳条件。方法：实验于2003-10／2004-06在中山大学附属第一医院外科实验室进行。以阳离子脂质体Oligofectamine转染体外培养的第2～6代人增生性瘢痕成纤维细胞，应用荧光显微镜记录荧光素在细胞内的空间分布，用流式细胞术作荧光细胞计数和观察细胞凋亡，通过不同细胞接种数量、反义寡核苷酸浓度和脂质体量转染条件的比较，逐步获得各转染过程中的最佳条件。结果：①在6孔板上转染反义寡核苷酸，所用各转染条件未引起细胞凋亡。②其最佳转染条件为：接种细胞数量32．25&;#215;10^4／皿，反义核酸浓度150nmol／L，脂质体量3μL／孔；转染后细胞浆和细胞核内均有荧光素聚集。结论：获得α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡核苷酸转染的人增生性瘢痕成纤维细胞的最佳转染条件，可为下一步试验提供基础。