高浓度低密度脂蛋白对血管内皮细胞NADPH氧化酶4 mRNA水平、活性氧产生及细胞凋亡的影响

目的:低密度脂蛋白进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧,在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用.实验拟进一步观察高浓度低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞活性氧、NADPH氧化酶4 mRNA 水平和凋亡的影响.方法:实验于2004-12/2006-02在卫生部老年医学重点实验室完成.①实验材料:脐带来自卫生部北京医院产科,产妇或家属签署知情同意书;低密度脂蛋白由卫生部北京医院老年医学研究所生化室经过超速离心提取.②实验过程及分组:分离人脐静脉内皮细胞.先以不同浓度的低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h以选取最佳的浓度,观察NADPH氧化酶4表达,分为:不加低密度脂蛋白的对照组;0.8 g/L 低密度脂蛋白组;1.6 g /L 低密度脂蛋白组;2.4 g/L低密度脂蛋白组.再以1.6 g/L 低密度脂蛋白浓度处理人脐静脉内皮细胞不同的时间以选取最佳的处理时间观察NADPH氧化酶4表达,分为:不加低密度脂蛋白的对照组,12 h处理组,24 h处理组,48 h处理组.以最佳浓度和最佳时间处理人脐静脉内皮细胞,并观察其NADPH氧化酶4表达、活性氧生成和凋亡.③实验评估:反转录-聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞中NADPH氧化酶的表达;流式细胞仪检测胞内活性氧生成量和细胞凋亡率,Hoechst 33342染色分析细胞凋亡.结果:①1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h后人脐静脉内皮细胞内活性氧生成量高于对照组(P＜0.05).②1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组细胞凋亡也比对照组明显增加(P＜.05).③用反转录-聚合酶链反应检测不同浓度(0.8,1.6,2.4 g/L)低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h和以1.6 g/L低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞不同时间(12,24和48 h)时NADPH氧化酶4 mRNA水平变化,结果显示与不加低密度脂蛋白的对照组相比,各组NADPH氧化酶4 mRNA表达均增强.结论:低密度脂蛋白上调人脐静脉内皮细胞内NADPH氧化酶4 mRNA表达,并促进细胞内活性氧生成和细胞凋亡.     

人突触相关蛋白抗原表位分析及多克隆抗体的制备

目的　泡沫化细胞差异表达基因FRG4经生物信息学分析 ,与人突触相关蛋白基因有很高同源性 ,经联机检索 ,有关突触相关蛋白的研究很少 ,与脂蛋白代谢、泡沫细胞形成和凋亡的关系没有报道。本文在对泡沫化相关基因FRG4分析的基础上 ,利用计算机软件进行抗原表位分析 ,制备特异的抗人突触相关蛋白的多克隆抗体 ,为进一步深入研究其表达和功能提供条件。方法与结果　①选取抗原多肽 :利用ExPASy软件和BioEdit软件对FRG4cDNA序列进行亲水性分析 ,预测其二级结构 ;使用Lasergene99软件预测其抗原决定族 ;根据亲水性、二级结构、偶联难易及实验难度选取抗原 13肽PKLVKEEVFWRNY。②多肽合成及交联 :采用美国ABI公司的多肽自动合成仪 ,以固相合成法合成 ,合成产物经高效液相色谱纯化检测 ,纯度达到 90 %以上 ;抗原多肽与血兰蛋白用BDB法交联 ,与不完全弗氏佐剂等体积混合包被。③动物免疫 :多点皮下注射抗原免疫新西兰兔 ,每两周强化免疫一次 ,第三次免疫后 10天取耳血测抗体效价 (ELISA法 )。④抗血清收获及检测 :第四次免疫后第十至十四天经颈动脉放血 ,分离抗血清 ,冷冻抽干 ,- 2 0℃保存。高效液相色谱检测显示抗体纯度达 82 .79% ,抗体滴度为 1∶16 0 0 0 ,免疫印迹方法检测在 4 0kDa处有一条带 ,与软件分析     

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与动脉粥样硬化

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是一种多亚单位酶复合体,是细胞中一种可诱发的电子传递系统.尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶目前被认为是血管内生成活性氧的主要酶体,它的激活受蛋白激酶C等信号途径介导.研究表明NADPH氧化酶和近年来新发现的gp91phox同工酶即NOX蛋白家族可能通过损伤血管内皮、促进低密度脂蛋白氧化等参与动脉粥样硬化的发生和发展.     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制研究

目的：观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞（vascular smooth musele cells,VSMC）的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）表达的影响。方法：采用多个浓度（2．5、5、10μmol／L）的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC 24h和48h;流式细胞术分析细胞凋亡率;RT-PCR检测泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）相关基因泛素、泛素活化酶（E1）、泛素缀合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、26S蛋白酶体和caspase 3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果：蛋白酶体抑制剂MG132处理48h后细胞凋亡率增加：细胞内UPP相关的基因rnRNA表达降低,而caspase 3 mRNA表达增高;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达水平升高。结论：蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导vSMC凋亡与下调UPP相关基因和上调caspase 3基因及蛋白的表达有关。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管内皮细胞凋亡及其机制

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人血管脐静脉内皮细胞（ECV-304）的致凋亡作用,并从泛素-蛋白酶体途径（UPP）相关基因E1、E2和E3及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表达初步探讨MG132的致细胞凋亡机制。方法采用蛋白酶体抑制剂MG132（2μmol/L和5μmol/L）处理ECV-304细胞;流式细胞术检测细胞凋亡率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测UPP相关基因E1、E2、E3和凋亡相关基因caspase-3的转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase-3蛋白表达。结果MG132处理组细胞的凋亡率明显增加;细胞内UPP相关基因E1、E2、E3 mRNA表达下降,而凋亡相关基因caspase-3 mRNA表达上调;细胞内caspase-3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导ECV-304细胞凋亡,其机制可能是MG132抑制UPP活性,使细胞内caspase-3蛋白降解减少,同时上调caspase-3基因转录而促进细胞凋亡。     

后适应的临床研究进展

自缺血预适应(ischemic preconditioning)的概念提出以来,有关内源性保护作用的研究引起了学术界的广泛关注,已证实缺血预适应可有效减轻缺血再灌注损伤,具有强大的心肌保护效应~([1]).     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人巨噬细胞THP-1凋亡

泛素-蛋白酶体途径是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一，广泛参与细胞周期调控、DNA修复、细胞信号转导、细胞凋亡等多种生理过程。为了研究调控泛素一蛋白酶体途径表达对巨噬细胞THP-1凋亡和细胞内载脂蛋白B的蓄积的影响，本实验采用蛋白酶体抑制剂MG132(5／μmol／L)处理THP-1细胞，流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞内载脂蛋白B含量，用半定量逆转录一聚合酶链反应检测细胞内UPP途径相关基因的表达。结果发现：MG132可以诱导THP-1细胞凋亡；实验组细胞内载脂蛋白B蓄积增加；实验组细胞内泛素活化酶、泛素缀合酶和泛素-蛋白连接酶mRNA表达均降低，而26S蛋白酶体mRNA无显著改变。结果提示，蛋白酶体抑制荆MG132能够诱导THP-1细胞凋亡，其机制可能与MG132抑制泛素-蛋白酶体途径中泛素活化酶、泛素缀合酶和泛素一蛋白连接酶活性，使细胞内载脂蛋白B经泛素-蛋白酶体途径降解减少，在细胞内蓄积而使细胞凋亡率增加。     

COVID-19心脏损伤的机制及防治策略

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)以血管紧张素转换酶2(ACE2)为受体侵入细胞引起机体感染,所引起的"细胞因子风暴"是2019冠状病毒病(COVID-19)爆发和死亡的重要原因。临床资料显示,2019-nCoV除了累及呼吸系统外,还伴随着心脏损伤,如急性心肌损伤、心律失常和爆发性心肌炎等。文章主要阐述2019-nCoV对心脏损伤的主要表现和发病机制及其相关防治策略。     

泛素-蛋白酶体途径与受体胞吞

泛素 蛋白酶体途径 (ubiquitin proteasomepathway ,UPP)是真核细胞内重要的蛋白质调控系统 ,可高度选择性地降解细胞内蛋白质 ,参与调节各种细胞生理过程。泛素化可能作为调节受体内化的一种修饰而介导受体胞吞 (receptorendocytosis) ,2 6S蛋白酶体可能参与了内化后受体到溶酶体的转运     

FGF-2上调Survivin蛋白的表达拮抗心肌细胞凋亡

目的探讨成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)拮抗心肌细胞凋亡的作用机制。方法以H9c2大鼠心肌细胞作为实验对象,用无血清培养基同步化培养24小时,心肌细胞随机分为正常组(Control)、缺氧/复氧(H/R)组和H/R+FGF-2组。采用CCK-8比色法检测心肌细胞存活率,Hoechst染色和流式细胞术检测心肌细胞凋亡。采用Western blot检测生存素(Survivin)蛋白的表达。结果与正常组相比,H/R明显抑制心肌细胞活力,诱导心肌细胞凋亡(均P<0.01);与H/R组相比,FGF-2显著改善H/R心肌细胞活力,拮抗H/R心肌细胞凋亡,同时上调Survivin蛋白的表达(均P<0.05)。结论 FGF-2拮抗心肌细胞凋亡的作用与其上调Survivin蛋白表达有关。