血管紧张素Ⅱ促进内皮细胞凋亡和NOX4表达

目的分析高浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)时细胞内活性氧(ROS)、NOX4 mRNA水平和细胞凋亡的变化。方法倒置显微镜下观察人脐静脉内皮细胞形态;免疫组化法检测人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的表达;RT-PCR检测HUVECs中NOX4的表达;流式细胞仪检测各组细胞内ROS生成量和细胞凋亡率,Hoechst染色分析细胞凋亡。结果高AngⅡ刺激HUVECs时,NOX4 mRNA表达上调,细胞内ROS生成增加,细胞凋亡增加。结论高AngⅡ上调HUVCEs内NOX4mR-NA表达并促进细胞内ROS生成和细胞凋亡。     

HDL抑制人脐静脉内皮细胞NADPH氧化酶4表达和活性氧生成

目的分析HDL对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)内NAD-PH氧化酶4(NADPH oxidase4,NOX4)及其亚组分p22phox、p67phox、Rac1与活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的影响,研究HDL对LDL的拮抗作用。方法用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养HUVEC;用RT-PCR、Western印迹观察NOX4、p22phox、p67phox、Rac1表达的变化;用流式细胞仪检测细胞内ROS的变化。结果HDL处理HUVEC能下调NOX4和p67phox mRNA和蛋白水平,但不影响p22phox和Rac1的表达。高浓度LDL刺激HUVEC时,NOX4表达上调,细胞内ROS生成增加,但p22phox、p67phox和Rac1的表达没有明显变化。用HDL预处理再加高浓度LDL刺激时,NOX4表达下调,ROS生成量减少;结论HDL可通过下调HUVEC NOX4表达降低ROS水平。     

胞红蛋白对巨噬细胞氧化损伤的保护作用

目的 探讨CYGB在巨噬细胞氧化损伤过程中的表达及作用。方法构建CYGB高表达/低表达巨噬细胞模型,Western blot检测不同浓度H₂O₂刺激RAW264.7 12 h后CYGB的蛋白表达水平;用分光光度计观察RAW264.7在氧化损伤过程中乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量的变化情况。结果0.5 mmol/L H₂O₂处理巨噬细胞12 h后CYGB表达水平明显高于空白对照组(P<0.05);与0.5 mmol/L H₂O₂处理组相比,0.5 mmol/L H₂O₂对CYGB高表达组的CYGB表达升高(P<0.05),而0.5 mmol/L H₂O₂对CYGB低表达组的CYGB表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);0.5 mmol/L H₂O₂₊CYGB高表达组中LDH活性和MDA含量下降;0.5 mmol/L H₂O₂₊CYGB低表达组中LDH活性和MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论巨噬细胞氧化损伤时CYGB表达水平增加;CYGB在巨噬细胞氧化损伤过程中具有拮抗作用。     

Kr(u)ppel样因子4对阿霉素诱导大鼠心肌细胞H9C2凋亡的影响

目的 探讨阿霉素对大鼠心肌细胞H9C2 凋亡的影响及Kr(u)ppel样因子4过表达对阿霉素所致H9C2细胞凋亡的影响.方法 采用台盼蓝染色检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blotting检测Kr(u)ppel样因子4及凋亡相关基因多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶的表达.结果 阿霉素能够诱导H9C2细胞凋亡,采用5 μmol/L阿霉素处理时,24 h变化最为明显;Kr(u)ppel样因子4过表达之后,细胞凋亡率较转空栽体组更高,达87.90%.阿霉素能够诱导Kr(u)ppel样因子4在H9C2细胞中表达增加;Kr(u)ppel样因子4过表达组多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶裂解片段的表达水平明显上调.结论 Kr(u)ppel样因子4能够促进阿霉素诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡,其作用机制与多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶有关.     

高浓度低密度脂蛋白对血管内皮细胞NADPH氧化酶4 mRNA水平、活性氧产生及细胞凋亡的影响

目的:低密度脂蛋白进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧,在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用.实验拟进一步观察高浓度低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞活性氧、NADPH氧化酶4 mRNA 水平和凋亡的影响.方法:实验于2004-12/2006-02在卫生部老年医学重点实验室完成.①实验材料:脐带来自卫生部北京医院产科,产妇或家属签署知情同意书;低密度脂蛋白由卫生部北京医院老年医学研究所生化室经过超速离心提取.②实验过程及分组:分离人脐静脉内皮细胞.先以不同浓度的低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h以选取最佳的浓度,观察NADPH氧化酶4表达,分为:不加低密度脂蛋白的对照组;0.8 g/L 低密度脂蛋白组;1.6 g /L 低密度脂蛋白组;2.4 g/L低密度脂蛋白组.再以1.6 g/L 低密度脂蛋白浓度处理人脐静脉内皮细胞不同的时间以选取最佳的处理时间观察NADPH氧化酶4表达,分为:不加低密度脂蛋白的对照组,12 h处理组,24 h处理组,48 h处理组.以最佳浓度和最佳时间处理人脐静脉内皮细胞,并观察其NADPH氧化酶4表达、活性氧生成和凋亡.③实验评估:反转录-聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞中NADPH氧化酶的表达;流式细胞仪检测胞内活性氧生成量和细胞凋亡率,Hoechst 33342染色分析细胞凋亡.结果:①1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h后人脐静脉内皮细胞内活性氧生成量高于对照组(P＜0.05).②1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组细胞凋亡也比对照组明显增加(P＜.05).③用反转录-聚合酶链反应检测不同浓度(0.8,1.6,2.4 g/L)低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h和以1.6 g/L低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞不同时间(12,24和48 h)时NADPH氧化酶4 mRNA水平变化,结果显示与不加低密度脂蛋白的对照组相比,各组NADPH氧化酶4 mRNA表达均增强.结论:低密度脂蛋白上调人脐静脉内皮细胞内NADPH氧化酶4 mRNA表达,并促进细胞内活性氧生成和细胞凋亡.     

人突触相关蛋白抗原表位分析及多克隆抗体的制备

目的　泡沫化细胞差异表达基因FRG4经生物信息学分析 ,与人突触相关蛋白基因有很高同源性 ,经联机检索 ,有关突触相关蛋白的研究很少 ,与脂蛋白代谢、泡沫细胞形成和凋亡的关系没有报道。本文在对泡沫化相关基因FRG4分析的基础上 ,利用计算机软件进行抗原表位分析 ,制备特异的抗人突触相关蛋白的多克隆抗体 ,为进一步深入研究其表达和功能提供条件。方法与结果　①选取抗原多肽 :利用ExPASy软件和BioEdit软件对FRG4cDNA序列进行亲水性分析 ,预测其二级结构 ;使用Lasergene99软件预测其抗原决定族 ;根据亲水性、二级结构、偶联难易及实验难度选取抗原 13肽PKLVKEEVFWRNY。②多肽合成及交联 :采用美国ABI公司的多肽自动合成仪 ,以固相合成法合成 ,合成产物经高效液相色谱纯化检测 ,纯度达到 90 %以上 ;抗原多肽与血兰蛋白用BDB法交联 ,与不完全弗氏佐剂等体积混合包被。③动物免疫 :多点皮下注射抗原免疫新西兰兔 ,每两周强化免疫一次 ,第三次免疫后 10天取耳血测抗体效价 (ELISA法 )。④抗血清收获及检测 :第四次免疫后第十至十四天经颈动脉放血 ,分离抗血清 ,冷冻抽干 ,- 2 0℃保存。高效液相色谱检测显示抗体纯度达 82 .79% ,抗体滴度为 1∶16 0 0 0 ,免疫印迹方法检测在 4 0kDa处有一条带 ,与软件分析     

新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位分析及抗体制备

目的：分析一个新的人突触相关蛋白(FRCA)抗原表位并制备其多克隆抗体。方法：从人胎肝文库PCR扩增获得FRCA基因全长cDNA序列；通过生物信息学分析，预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域，并进行了多序列比对；采用固相多肽合成法合成了FRCA抗原多肽，并免疫家兔；用免疫组化检测蛋白在人肝癌细胞HepG2细胞中的表达。结果：通过生物信息学分析选取抗原13肽PKLVKEEVFWRNY，制备兔抗人FRCA多克隆抗体。高效液相色谱检测显示抗体纯度达82．79％，抗体滴度为1：16000，Western blot证实该抗体具有较好的反应性和特异性，免疫组化证实其主要在HepG2细胞胞浆中表达。结论：成功制备了新的人突触相关蛋白(FRCA)多克隆抗体。     

MG132诱导人血管内皮细胞凋亡及对p53表达的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人血管脐静脉内皮细胞(ECV-304)细胞的致凋亡作用及其对凋亡相关基因p53表达的影响。方法采用两个浓度(2μmol/L,5μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理ECV-304细胞24 h;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞化学检测p53蛋白表达。结果对照组ECV-304细胞凋亡率低于5%,在2μmol/L MG132作用下,凋亡率为11.3%±1.2%,MG132浓度升至5μmol/L时,细胞凋亡率增至44.5%±5.3%;免疫组化检测p53蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导血管内皮细胞凋亡,其机制可能与MG132上调p53基因表达有关。     

MG132诱导HepG_2细胞凋亡及其对p53表达的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人肝癌细胞系HepG2的致凋亡作用及其对凋亡相关基因p53蛋白表达的影响。方法采用多个浓度(2,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理HepG2细胞;流式细胞术和Hoechst荧光染色检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测HepG2细胞p53蛋白含量。结果对照组HepG2细胞凋亡率低于5%,在2,5,10μmol/LMG132作用下,细胞凋亡率分别为42.9%,66.1%和72.8%,MG132诱导HepG2细胞凋亡具有剂量—效应关系。经Hoechst荧光染色可见细胞染色质浓缩等凋亡改变。免疫组织化学检测HepG2细胞p53蛋白表达水平增高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导HepG2细胞凋亡,其作用呈剂量—效应关系;p53蛋白表达增加与MG132抑制泛素—蛋白酶体系统降解细胞内p53蛋白有关。     

心肌细胞缺氧复氧损伤时Mipu1启动子活性、Mipu1 mRNA表达变化及意义

目的探讨心肌细胞缺氧复氧损伤时心肌缺血预适应表达上调蛋白1(Mipu1)启动子活性的变化及其作用。方法按本课题组的常规方法复制心肌细胞缺氧复氧模型,先予缺氧(95%N2-5%CO2,无血清低糖DMEM)处理6 h,再分别复氧(95%空气-5%CO2,10%FBS-高糖DMEM)6、12、24 h。采用MTT法检测心肌细胞活性,比色法测定心肌细胞LDH活性,双荧光素酶报告基因技术检测启动子PGL3-Mipu1活性,实时定量PCR法检测Mipu1mRNA表达。结果缺氧6 h复氧(6、12、24 h)后心肌细胞活性减低,LDH释放增加,启动子PGL3-Mipu1活性增加,Mipu1 mRNA表达上调,且在缺氧6 h复氧12 h时变化最明显。结论 Mipu1可能参与了心肌细胞的缺氧复氧损伤,其可能通过调控凋亡相关基因发挥作用。