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目的 构建靶向白血病干细胞CD123的融合蛋白,检测其表达效果及其识别白血病干细胞的活性。方法 采用PCR法扩增白细胞介素-3(IL-3)和毒素蛋白(LP)的编码DNA序列,经酶切、连接,克隆至表达载体pAYZ,转化大肠杆菌E.coli 16C9,鉴定阳性克隆菌落,经低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白IL-3-G4S-LP,用CM-FF阳离子柱和抗-Etag亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,流式细胞术测定其与红白血病细胞TF1的结合活性。结果 构建的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白表达,纯化后纯度达95 %以上,表达量约为1 mg/L,并有与白血病干细胞表面IL-3受体α亚基(CD123)特异性结合的活性。结论 构建的融合蛋白IL-3-G4S-LP具有与白血病干细胞结合的特性,可望成为复发和耐药白血病的治疗药物。 相似文献
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目的通过建立一种体外稳定培养单个造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的实验方法,在未来筛选可以促进HSC体外扩增的化合物。方法通过配制HSCs体外培养液并结合流式分选技术,我们建立了一种在体外不需要基质细胞支持的,稳定的,高通量培养单个HSC形成一个血细胞集落的实验方法。结果只需培养10~14 d即可观察到化合物对HSC的作用,并结合流式细胞分析技术替代人工计数血细胞分化情况,进一步节省人力,具有客观、重复性强的特点,满足了高通量筛选药物的要求,为后续的研究和化合物筛选工作打下基础。为了验证此方法的可靠性,使用BIO(一种通过抑制糖原合成酶激酶-3,进而可以促进HSC自我更新的化合物)时,实验结果与文献报道的研究结果一致。结论该实验方法在有关造血干细胞体外扩增的药物筛选方面具有很好的应用价值。 相似文献
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目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性。方法:利用PCR方法构建不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定。通过间接免疫荧光法和竞争性免疫荧光结合流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:无Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体经测序证实其序列正确。SDS-PAGE电泳显示2条带,相对分子质量(Mr)分别为25000和26000,与预期Mr相符。去除Etag的Dia-body[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合阳性率分别为89.87%和83.95%。竞争结合实验中,与K562/A02和Jurkat细胞竞争后结合率分别为50.25%和43.78%。结论:成功构建了不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体、进行原核表达及纯化。不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]能特异性结合CD3和Pgp靶抗原,Etag标记去除后其生物学活性没有降低。 相似文献
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目的 探讨阿糖胞苷(Ara-c)对白血病细胞(K562)B7分子表达以及对T细胞免疫应答的影响.方法 用流式细胞术检测K562细胞经Ara-c处理后町分子的表达以及对T细胞表面标记的影响.MTT法检测不同效靶比的情况下,诱导后的K562细胞对外周血单个核细胞(PBMNC)的刺激作用,以及用RT-PCR法检测B7分子刺激PBMNC分泌细胞因子γ干扰素(IFN-γ)的测定.结果 Ara-c能刺激K562细胞B7分子的表达,呈时间依赖性.诱导后的K562细胞显著刺激PBMNC增殖并产生IFN-γ,并能检测到T细胞表面标记.结论 Ara-c通过刺激K562细胞B7分子表达,显著提高了白血病细胞的免疫原性. 相似文献
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目的确认整合素αvβ3新型抑制剂3,5-二氯苯基双胍对人黑色素瘤肺转移的抑制作用。方法应用前期建立的人黑色素瘤裸鼠肺转移模型,观察3,5-二氯苯基双胍的治疗效果。裸鼠尾静脉接种黑色素瘤细胞(第1天)后,于第5、9、13、17和21天给予该药物治疗。50 d实验结束,处死裸鼠并取完整的肺组织,Bouin氏液固定24 h后根据肺表面癌结节的大小和数量给予评分,以此评价肺转移的程度。结果3,5-二氯苯基双胍6、12 mg/kg和24 mg/kg治疗组的转移分数分别为(55.25±13.60)、(35.13±17.36)和(12.83±11.44),与溶剂对照组(转移分数是82.50±17.72)相比具有明显差异(P<0.05)。阳性对照组的转移分数为(11.50±10.44)(P<0.05 vs溶剂对照组),阴性对照组和PBS对照组的转移分数分别为(88.50±17.21)、和(88.87±11.29)(P>0.05 vs溶剂对照组)。结论3,5-二氯苯基双胍在裸鼠体内能够明显抑制黑色素瘤肺转移,并呈现一定的剂量依赖性。 相似文献
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目的 探讨阿糖胞苷对抗CD3/抗P-gP双功能抗体介导的T淋巴细胞免疫杀伤多药耐药白血病细胞的影响.方法 采用抗E-tag亲和层析柱分离纯化抗CD3/抗P-gp微型双功能抗体,用阿糖胞苷刺激K562和K562/A02细胞,并用流式细胞术检测K562和K562/A02细胞B7-1、B7-2分子的表达,用CytoTox 96非放射性细胞毒试剂盒检测阿精胞苷对抗CD3/抗P-gp双功能抗体介导的T淋巴细胞免疫杀伤K562/A02细胞的影响.结果 经阿糖胞苷刺激的K562和K562/A02细胞B7-1、B7-2分子的表达较未刺激的对照组明显升高.阿糖胞苷对抗CD3/抗P-gp双功能抗体介导的T淋巴细胞在效靶比0.39:1~25:1范围内,激活T细胞对耐药白血病细胞的杀伤率为(16.44±1.20)%~(60.49 ± 2.90)%,其杀伤率与效靶比和抗体浓度呈依赖关系(P<0.05).结论 阿糖胞苷可明显提高抗CD3/抗P-gp双功能抗体介导的人T淋巴细胞对高表达P-gp抗原的耐药白血病细胞的杀伤效应. 相似文献
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目的通过同源模建、计算机虚拟筛选和生物活性筛选,寻找新型的CDK9小分子抑制剂。方法采用同源模建方法得到CDK9的三维晶体构象,用DOCK(分子对接)对小分子三维数据库进行虚拟筛选。采用MTT法对挑选出的化合物进行生物活性测定,然后挑选高活性的化合物进行CDK9与小分子之间相互作用的研究,验证化合物对CDK9激酶活性的抑制作用。结果用DOCK程序对三维化合物库虚拟筛选后挑选出得分高的前1000个化合物,按结构差异化分类,最终选择并购买了27个代表性化合物进行进一步生物学活性测定。27个化合物中12个化合物明显抑制肿瘤细胞的增殖,其中1个化合物C-21的半数抑制浓度(IC50)在20μmol.L-1以下。选择C-21类化合物进一步进行研究,结果显示此化合物能够有效抑制各类肿瘤细胞系的增殖。酶学水平研究表明此类化合物能够有效抑制CDK9激酶活性,并在较低浓度范围内呈明显的剂量依赖关系。结论通过同源模建、计算机虚拟筛选、生物活性实验和分子水平研究,得到了一类靶向CDK9的全新的先导化合物。 相似文献
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本研究旨在探讨SNS-032(C17H24N4O2S2)对小鼠骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)细胞周期、凋亡、分化及自我更新的影响及其可能的相关机制。利用极限稀释实验检测SNS-032作用前后HSC自我更新的变化,用流式细胞术检测SNS-032作用前后小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+Sca-1+及Lin-c-kit+Sca-1-表型细胞的细胞周期及凋亡的变化,用实时定量PCR检测SNS-032作用前后细胞周期相关基因、凋亡相关基因及HSC自我更新相关基因mRNA表达量的水平。结果显示,SNS-032处理后,小鼠骨髓细胞中HSC的自我更新能力没有明显变化;加SNS-032处理后,小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞的细胞周期无统计学意义的变化(P〉0.05),小鼠骨髓Lin-c-kit+Sca-1-表型细胞的G1期细胞增多(P〈0.05);小鼠骨髓细胞Lin-c-kit+Sca-1+表型细胞和Lin-c-kit+Sca-1-表型细胞的细胞凋亡增多,与对照相比均无显著性差异(P〉0.05)。小鼠骨髓细胞经SNS-032处理后,HSC周期相关基因CDK1、CDK2、CDK7、p27的表达量均明显降低(P〈0.05),而CDK4,CDK6,p21,p18,p19,p16的表达与对照组相比没有明显变化(P〉0.05)。凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Puma和p53表达量与对照组相比没有明显区别(P〉0.05),与干细胞自我更新相关的基因中Bim,Sall4,Notch1表达量升高,但与对照组相比没有显著性差异(P〉0.05)。结论:SNS-032没有明显的抑制正常造血干细胞自我更新、分化作用,而且SNS-032没有明显的诱导正常造血干、祖细胞的凋亡作用。 相似文献
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目的探索木香烃内酯对白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素耐药的逆转作用。方法将木香烃内酯与K562/A02细胞共培养72 h后,采用MTT法检测木香烃内酯对细胞生长的抑制作用。不同浓度木香烃内酯处理K562/A02细胞24 h后,采用Annexin V和PI双染法检测木香烃内酯对细胞的凋亡。不同浓度木香烃内酯与阿霉素共培养72 h后采用MTT法检测木香烃内酯对K562/A02细胞的耐药逆转情况。采用流式细胞仪检测木香烃内酯处理24 h之后K562/A02细胞阿霉素蓄积以及细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)的表达。结果木香烃内酯对K562/A02细胞的生长具有明显抑制作用,呈显著的剂量相关性。与对照组比较,2.5~50μmol/L木香烃内酯组K562/A02细胞存活率显著降低(P0.05、0.01、0.001)。随着木香烃内酯浓度的增加,凋亡细胞的比例明显增加。与对照组比较,不同浓度木香烃内酯组细胞凋亡比例显著升高(P0.05、0.01、0.001)。加入5μmol/L木香烃内酯后,使K562/A02细胞对阿霉素的敏感性提高12倍。木香烃内酯处理后K562/A02细胞内部阿霉素的蓄积明显增加,呈浓度相关性。与对照组比较,5、10μmol/L木香烃内酯组K562/A02细胞内部阿霉素的蓄积增加显著升高(P0.05)。细胞表面的P-gp的表达并无显著影响。结论木香烃内酯能够抑制K562/A02细胞增殖,诱导K562/A02细胞凋亡,增强阿霉素的化疗敏感性,逆转阿霉素耐药。 相似文献
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目的:研究二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody)在体外和体内的稳定性.方法:将抗CD3/抗Pgp Diabody置于37℃含0.2%人血清白蛋白(human serum albumin,HSB)的PBS中,孵育不同时间后,用流式细胞术(FACS)检测其结合活性.建立K562/A02裸鼠移植瘤模型,用Cy5荧光标记试剂盒标记抗CD3/抗Pgp Diabody,通过尾静脉注射给荷瘤裸鼠,在小动物活体成像系统上动态观察荧光信号.结果:二硫键稳定的抗CD3/抗Pgp Diabody (Ds-diabdoy)体外孵育72小时后活性无明显下降,而改造前Diabody孵育1小时后活性即开始下降,24小时后活性完全丧失.Ds-diabdoy注射后72小时仍能在肿瘤部位检测到荧光信号,而改造前Diabody在注射后24小时肿瘤部位荧光信号消失. 结论:Ds-diabdoy较改造前Diabody稳定性大大提高. 相似文献