microRNA-1抑制心肌特异性Dicer基因缺失小鼠心脏病理性重构

目的 探讨microRNA-1(miR-1)对他莫昔芬(tamoxifen,TMX)诱导的心肌特异性Dicer 基因缺失小鼠心脏结构重构及心功能的影响.方法 采用Myh6-Cre/Loxp重组系统,通过Dicerloxp/1oxp小鼠和Myh6-creERT小鼠杂交,获得Myh6-creERT/Dicerloxp/loxp小鼠.将18只8周龄雄性Myh6-creERT/Dicerloxp/loxp小鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、miR-1治疗组.采用腹腔注射20 mg/mL TMX溶液(0.1 mL),连续注射5d,建立心肌特异性Dicer基因缺失心力衰竭小鼠模型,对照组腹腔注射玉米油;模型建立后,miR-1治疗组通过尾静脉注射miR-1类似物(miR-1 mimic) 10 nmol/只,对照组给予同等剂量生理盐水,模型组给予miRNA阴性对照试剂,2次/周.1周后,经胸二维超声心动图检测各组小鼠舒张末期左室内径(LVIDd)、收缩末期左室内径(LVIDs)、舒张末期左室容积(EDV)、收缩末期左室容积(ESV)、射血分数(EF)及左室短轴缩短率(FS),然后收集心肌标本,通过HE染色、Masson三色染色及天狼猩红染色观察小鼠心肌结构重构程度;利用原位缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)免疫荧光染色检测心肌组织细胞凋亡情况;通过细胞增殖指标Ki67免疫组化染色评估细胞增殖水平.结果 建模后1周,模型组小鼠心功能明显下降,LVIDs及ESV均高于对照组(P＜0.05),EF及FS则显著低于对照组(P＜0.05),miR-1治疗后上述指标均较模型组明显改善(P＜0.05).组织病理学检测结果显示,与对照组相比,模型组小鼠心肌细胞排列紊乱,细胞肥大,炎症细胞浸润明显,心肌纤维化显著,而治疗组小鼠心肌细胞形态正常,无明显肥大和炎性浸润,未见明显的间质纤维化;TUNEL免疫荧光染色及Ki67免疫组化染色结果显示,miR-1治疗组小鼠较模型组心肌组织凋亡比例增加(P＜0.05),且存在较明显的细胞增殖(P＜0.05).结论 miR-1可抑制TMX诱导的心肌特异性Dicer基因缺失心力衰竭模型中心肌细胞的固有改变和间质的改变,抑制心脏结构重构,维持心功能.     

结缔组织生长因子与组织器官纤维化机制研究

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CT-Gr)是转化生长因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)的下游介质，具有明显的有丝分裂原性和趋化性，在体内参与胚胎发育、细胞增生、分化及创伤愈合等。1988年CTGF首次被命名为纤维母细胞诱导分泌的蛋白质12(fisp-12)，1991年Brunner等报道了fisp-12的基因结构并提出其蛋白序列的构想。     

靶向腺病毒载体介导的EGFP基因在甲胎蛋白阳性肝癌细胞的特异表达

目的：建立一种在甲胎蛋白(AFP)阳性的肝癌细胞中靶向表达目的基因的重组腺病毒载体。方法： 基于腺病毒载体Adeno-XTM Expression system,以300 bp AFP特异启动子替换穿梭质粒Pshuttle中CMV启动子，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因亚克隆至Pshuttle，HEK293细胞包装腺病毒，收集病毒后分别转染人正常肝脏LO2细胞，人肝癌HepG2细胞及HeLa细胞；通过Northern杂交检测EGFP基因在3种细胞中的转录水平，荧光显微镜下观察3种细胞中绿色荧光蛋白的表达。结果：Northern杂交显示，HepG2细胞中有大量EGFP基因的转录，而正常肝细胞LO2和HeLa细胞中仅能检测到微量基因的转录；荧光显微镜检测发现HepG2细胞内有强绿色荧光表达，而在LO2以及HeLa细胞内见极弱绿色荧光。 结论： 在AFP特异启动子作用下，腺病毒携带的目的基因在AFP阳性的肝癌细胞中得到显著转录和表达，而在非AFP阳性细胞仅微量转录，蛋白表达极弱。该腺病毒载体可作为AFP阳性的肝癌基因靶向治疗的适宜载体。     

"肝癌一号"对裸鼠人肝癌移植瘤生长的抑制作用及机制研究

目的 观察抗癌复方"肝癌一号"对裸鼠肝移植瘤生长的影响并分析其机制. 方法 24只5周龄Balb/C 裸鼠,皮下注射HepG2肝癌细胞1.0×106个,待肿瘤长大至8～10mm时,随机分成实验组和对照组(各12 只).分别给予"肝癌一号"提取液2ml(1 600mg)/d或生理盐水2ml/d灌胃.21d后,处死裸鼠,记录皮下肿瘤大小并称重;TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况;Western-blot和免疫组化方法检测肿瘤组织bcl-2和bax蛋白表达水平. 结果 "肝癌一号"治疗21d后,虽然肿瘤体积较治疗前有所增大(t=5.76,P＜0.01),但明显小于对照组(t=12.35,P＜0.01),抑癌率为31%;肿瘤组织凋亡指数分别为(45.7±6.6)%和(11.7±4.8)%;"肝癌一号"的bcl-2蛋白表达量明显低于对照组(t=8.64,P＜0.01),而bax蛋白表达量明显高于对照组(t=9.23,P＜0.01).结论 诱导肿瘤组织bax基因表达同时抑制bcl-2基因表达,促使肿瘤细胞的凋亡是抗癌复方"肝癌一号"抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤生长的原因之一.     

携多药耐药基因1反义RNA重组腺病毒逆转肝癌多药耐药细胞的实验研究

目的探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)反义RNA重组腺病毒载体在裸鼠体内逆转肝癌多药耐药细胞HepG2/阿霉素(adriamycin,ADM)的疗效及作用机制。方法构建携带AFP和asmdr1的重组腺病毒载体Adeno-asmdr1,ADM分级诱导肝癌细胞HepG2为多药耐药细胞HepG2/ADM,建立HepG2/ADM裸鼠皮下移植瘤模型,Adeno asmdr1局部注射,观察移植瘤的体积、透射电镜检测移植瘤组织细胞凋亡、RT-PCR检测MDR1转录水平,评价Adeno-asmdr1的抗肿瘤活性。结果在Adeno-asmdr1 ADM组,移植瘤体积无增大,而PBS组、ADM组体积明显增大;RT-PCR检测移植瘤细胞1周和4周MDR1 mRNA水平, ADM组无明显变化,Adeno-amdr1 ADM组在4周时MDR1转录水平仅为单纯ADM组的20%,经ADM Adeno-asmdr1处理组,可见凋亡增加,ADM组和PBS处理组的裸鼠移植瘤组织中出现少量或没有凋亡。结论携带MDR1反义RNA重组腺病毒部分逆转HepG2/ADM的多药耐药,阻止肿瘤生长,下调MDR1转录水平,导致肿瘤细胞凋亡。     

E2A-PBX1融合基因的实时定量检测在小儿急性淋巴细胞白血病微小残留病监测中的应用

目的：实时荧光定量PCR方法检测E2A-PBX1融合基因的表达水平,探讨其在监测急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿微小残留病（MRD）及判断预后中的临床价值。方法：采用实时荧光定量RT-PCR方法,动态检测11例E2A-PBX1融合基因阳性的ALL患儿在初治期（11例）、完全缓解期（11例）、复发期（3例）和10例同期骨髓细胞形态学正常的非血液及肿瘤疾病对照组患儿的E2A-PBX1融合基因表达水平。结果：11例ALL患儿初治期和复发期的E2A-PBX1基因表达水平均显著高于缓解期及对照组（P<0.01）。与诱导缓解治疗第33天E2A-PBX1水平表达阴性的患儿比较,表达阳性的患儿3年的复发率增高,无病生存率降低（均P<0.05）。结论：实时荧光定量RT-PCR检测E2A-PBX1融合基因的表达水平是监测MRD、预测复发、指导个体化治疗的良好指标,诱导缓解第33天E2A-PBX1融合基因水平可用于判断预后。     

门静脉高血压胃病发病机制研究进展

自从Ｓａｒｆｅｈ于 1986年正式提出门脉高压性胃病 (ＰｏｒｔａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｇａｓｔｒｏｐａｔｈｙＰＨＧ)以来 ,大量临床资料显示 ,ＰＨＧ出血约占肝硬化门脉高压上消化道出血的 30 %～ 80 % ,日益受到临床重视 ,对其发病机制也作了大量研究 ,取得了一些进展     

内毒素血症时小肠黏膜损害的实验研究

目的观察大鼠内毒素血症早期枯否细胞(KC)在小肠黏膜损害中的作用及氯化钆(GdCl3)阻断KC功能后对肠道完整性的影响。方法将大鼠分为3组。A组:单纯注入内毒素;B组注入内毒素之前24h先经静脉注入GdCl3;C组:假手术对照组。注射内毒素后4h处死大鼠,取材并收集胆汁。光镜下观察回肠黏膜的形态学变化。分离大鼠的KC,用RT-PCR检测KC中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)mRNA的表达。采用ELISA检测胆汁和血浆中TNF-α和IL-6水平的变化。结果A组回肠黏膜绒毛上皮表浅坏死,伴中性粒细胞浸润以及上皮脱落;B组回肠黏膜损害明显减少;C组回肠黏膜的形态学无改变。A组KC表达TNF-α和IL-6mRNA显著;B组表达明显减少;C组表达不明显。A组胆汁中TNF-α和IL-6的水平分别为(1032±107)pg/ml和(1185±127pg/ml,血浆中TNF-α和IL-6的水平分别为(207±29)pg/ml和(213±33)pg/ml,显著高于B组犤(521±76)pg/ml和(572±54)pg/ml,(113±18)pg/ml和(147±22)pg/ml犦及C组犤(72±13)pg/ml和(118±22)pg/ml,(67±10)pg/ml和(109±18)pg/ml犦(P均<0.05)。结论内毒素血症早期K释放的TNF-α和IL-6在回肠黏膜损害的启动和进程中可能起重要作用。     

人工合成小分子多肽P16抑制大鼠肾小管上皮细胞纤维化的初步研究

目的 观察人工合成的与结缔组织生长因子(CTGF)同源的16个氨基酸小分子多肽(P16)能否与CTGF竞争性地和CTGF受体相结合,以阻止大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化为肌纤维母细胞,并抑制细胞纤维化的发生.方法 以NRK-52E细胞株为实验对象,用异硫氰酸荧光素标记P16(FITC-P16),激光共聚焦显微镜观察P16和CTGF与细胞竞争性结合能力.用CTGF诱导NRK-52E细胞并加入P16竞争结合,通过细胞免疫荧光和RT-PCR分别在蛋白和基因水平上检测反映NRK-52E细胞向肌纤维母细胞转化的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth action muscle protein, α-SMA)和反映NRK-52E细胞纤维化的胶原Ⅰ和Ⅳ.结果 CTGF能诱导NRK-52E细胞高表达α-SMA和胶原Ⅰ、Ⅳ.P16可与CTGF竞争性结合细胞表面的整合素аvβ3,并显著抑制CTGF诱导的α-SMA和胶原Ⅰ、Ⅳ高表达.结论 人工合成的小分子多肽P16可通过与CTGF竞争性结合于细胞表面,显著抑制CTGF的促细胞转分化和纤维化作用,可望成为抗纤维化治疗的一种新策略.