Shikonin Directly Inhibits Nitric Oxide Synthases: Possible Targets That Affect Thoracic Aorta Relaxation Response and Nitric Oxide Release From RAW 264.7 Macrophages

Recently, an isomeric mixture of herbal anti-inflammatory naphthoquinones shikonin and alkannin, and their derivatives, have been found to impair cellular responses involving nitric oxide (NO) and NO synthesis, like the acetylcholine-induced relaxation response of rat thoracic aorta and NO release from murine RAW 264.7 macrophages. However, the mechanisms of such effects, including whether NO synthase (NOS) activity is affected, remained unclear. We herein investigate possible targets of shikonin in these NOS-related events. Shikonin by itself dose-dependently inhibited the rat thoracic aorta relaxation in response to acetylcholine (pD′₂ value: 6.29). Its optical enantiomer, alkannin, was equally inhibitory in the aorta relaxation–response assay. In RAW 264.7 cells, shikonin inhibited the lipopolysaccharide-induced NO production by 82% at 1 μM. A cell-free assay to verify direct effects on NOS activity showed that shikonin inhibits all isoforms of NOS (IC₅₀ s, 4–7 μM), suggesting NOS as an inhibition target in both the events. Further possible targets of shikonin that might be involved in the inhibitions of the acetylcholine-induced aorta relaxation response and the NO generation by RAW 264.7 cells are also discussed. It is shown for the first time that shikonin inhibits NOS activity.     

紫草素在Caco-2细胞的摄取特性

目的:研究紫草素(SKN)在Caco-2细胞的摄取特性.方法:以Caco-2细胞单层模型研究紫草素的细胞摄取规律.采用高效液相色谱法测定细胞中SKN浓度,考察时间、pH、药物浓度及抑制剂对Caco-2细胞摄取SKN的影响.结果:SKN在Caco-2细胞中的摄取呈时间依赖性;SKN在0.2 ～3.2 mg·L-1内的摄取呈线性增加,符合被动扩散过程;pH 8.0条件下药物的细胞摄取量(0.350±0.004) mg·g-1显著低于pH 5.0[(0.450±0.008) mg·g-1,P＜0.01];加入维拉帕米,叠氮化钠及2,4-二硝基酚后,与对照组相比,SKN的细胞摄取量显著低,分别为(0.320±0.007),(0.340±0.003),(0.260±0.007) mg·g-1(P ＜0.01).结论:SKN的细胞摄取机制主要是被动转运;P-糖蛋白未参与SKN的转运过程.     

4种细胞毒活性方法评价紫草素体外肿瘤细胞抑制作用效果

目的研究4种细胞毒活性测定方法对紫草素体外肿瘤细胞抑制作用的评价效果,对紫草萘醌为代表的天然色素在细胞毒活性评价中常出现的假阴性现象进行对比分析。方法将紫草素与其高敏感株急性早幼粒白血病HL-60细胞和低敏感株人非小细胞肺癌A549细胞体外共培养,通过台盼蓝法、磺酰罗丹明B(SRB)法、Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和四甲基偶氮唑盐(MTT)法进行平行实验,测定紫草素在0.4～128μmol/L抑制细胞生长的量效关系曲线。结果台盼蓝法、SRB法、CCK-8法、MTT法测得紫草素对HL-60细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.57、0.77、1.36、1.01μmol/L,对A549细胞的IC50分别为6.30、10.38、13.48、15.24μmol/L。紫草素浓度分别在3.2、32μmol/L以下时,4种检测方法得到其对2种细胞的抑制率均呈线性增长,超过此浓度即出现差异。其中台盼蓝法与SRB法结果一致性良好,而MTT法与CCK-8法测得的抑制率较低。对于HL-60细胞,紫草素12.8μmol/L时,CCK-8测得抑制率为81%,台盼蓝法为96%;对于A549细胞,紫草素128μmol/L时,MTT法测得抑制率为89%,台盼蓝法为99%。紫草素的吸收光谱与甲臜在波长400～600 nm存在重叠,最大重叠峰在550～570nm,CCK-8试剂与紫草素对HL-60细胞存在协同抑制效应。台盼蓝法结果显示高浓度紫草素几乎完全杀死板孔内细胞,相比对照组差异显著,但MTT法和CCK-8法结果出现假阴性。结论紫草萘醌为代表的天然色素的细胞毒活性评价不建议使用MTT法和CCK-8法,推荐使用SRB法和台盼蓝法。     

CD133抗体修饰的紫草素微乳的制备及抗三阴性乳腺癌研究

目的评价CD133抗体修饰的紫草素微乳(anti CD133 antibody-modified shikonin-loaded microemulsion,Anti CD133Ab-SKN-MEs)治疗三阴性乳腺癌的可行性及优势。方法利用经典的成乳工艺制备紫草素微乳(SKN-MEs),再通过EDC/NHS缩合技术制备Anti CD133Ab-SKN-MEs,以粒径、Zeta电位、包封率为指标优化投料比、抗体修饰密度等工艺参数;采用MTT法考察三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖行为,利用异硫氰酸荧光素(FITC)作为探针定性定量考察细胞摄取行为,借助膜联蛋白V-PE/7-氨基放线菌素D(Annexin V-PE/7-AAD)试剂盒考察给药组诱导细胞凋亡行为;借助悬浮培养技术富集MDA-MB-231干细胞,通过各给药组孵育观察细胞成球性以及CD133+细胞率;建立裸鼠MDA-MB-231异位移植瘤模型,设生理盐水、紫草素(SKN)、SKN-MEs、Anti CD133Ab-SKN-MEs,4 mg/kg隔天iv 5次,观察肿瘤体积、裸鼠生存时间、抑瘤率和CD133+细胞比率。结果 Anti CD133Ab-SKN-MEs的最佳质量比为1.0%,抗体密度为0.025%,粒子形态圆整,粒径为(31.4±2.1)nm,电位为(-18.7±2.5)m V,包封率为(93.6±2.8)%;Anti CD133Ab-SKN-MEs对MDA-MB-231细胞的IC50为(1.53±0.43)μg/m L,细胞摄取显著高于SKN和SKN-MEs,孵育8 h可诱导(67.9±4.2)%细胞凋亡;Anti CD133Ab-SKN-MEs可以显著抑制MDA-MB-231干细胞的成球性,明显降低CD133+细胞率;Anti CD133Ab-SKN-MEs体内抑瘤率为78.5%,69 d后仍有12.5%裸鼠存活,瘤组织CD133+细胞率显著降低。结论与SKN相比,Anti CD133Ab-SKN-MEs在治疗三阴性乳腺癌方面优势明显,机制可能与降低肿瘤细胞干性作用有关。     

紫草素及其衍生物抗肿瘤作用研究进展

紫草素是从草本植物紫草Arnebiae Radix中提取的一种具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、促伤口愈合等生物活性的萘醌类化合物。近年来,紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用被广泛研究。从构效关系、抗肿瘤作用机制等方面综述近5年紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用的研究进展,以期为紫草素类化合物的研究及利用提供参考。     

Shikonin Derivative DMAKO‐05 Inhibits Akt Signal Activation and Melanoma Proliferation

DMAKO‐05((S)‐1‐((5E,8E)‐5,8‐bis(hydroxyimino)‐1,4‐dimethoxy‐5,8‐dihydronaphthalen‐2‐yl)‐4‐methylpent‐3‐enyl 3‐methylbutanoate) is a novel oxime derivative of shikonin, the major component extracted from Chinese herb Lithospermun erythrorhizon. Here, we report that DMAKO‐05 had an antitumor activity against mouse melanoma cell line B16F0. Our studies indicated that DMAKO‐05 not only inhibited B16F0 proliferation and migration but also led to cell cycle arrest at G1 phase and cell apoptosis, in which DMAKO‐05 triggered mitochondrial‐mediated apoptosis signal including caspase‐9/3 and PARP. In response to DMAKO‐05 treatment, the Akt‐mediated survival signals were remarkably attenuated in B16F0 cells. Collectively, DMAKO‐05 has a strong cytotoxicity in B16F0 cells via inhibiting Akt activation, inducing G1 arrest, and promoting B16F0 cell apoptosis. DMAKO‐05 might serve as a potential candidate lead compound for melanoma.     

2-氨基磷酸茚处理对新疆紫草悬浮细胞次生代谢物积累的影响

用不同浓度2-氨基磷酸茚(AIP),并结合茉莉酸甲酯(Me JA)处理新疆紫草悬浮细胞,测定不同处理组、不同处理时间细胞中迷迭香酸及乙酰紫草素、脱氧紫草素、β,β'-二甲基丙烯酰紫草素、异戊酰紫草素等次生代谢物的含量,考察AIP抑制苯丙氨酸通路后对紫草悬浮细胞中次生代谢物合成、积累的影响。结果显示Me JA处理能够明显促进新疆紫草细胞中次生代谢物的合成积累;AIP处理能够抑制新疆紫草细胞中上述次生代谢物的积累,并在二者联合处理时能一定程度上抵消Me JA的促进作用,且抑制作用的强弱与处理剂量、处理时间存在正相关性。表明苯丙氨酸途径在紫草素类化合物生物合成中具有重要作用,可为通过细胞培养方式生产紫草素类化合物的代谢调控及紫草素类化合物生物合成等进一步研究提供参考。     

阿卡宁的氧葡萄糖醛酸化代谢通路研究

目的对紫草素的立体异构单体阿卡宁的氧葡萄糖醛酸代谢通路进行研究和表征。方法采用液相色谱和质谱联用方法检测阿卡宁和其葡萄糖醛酸化代谢产物;将阿卡宁在人肝微粒体(HLM)、人肾微粒体(HKM)以及重组人类葡萄糖醛酸转移酶(UGT)中孵育,观察代谢轮廓、筛选参与催化的重组单酶、考察酶动力学;通过相关性分析以及化学抑制实验阐明UGT单酶对阿卡宁的选择性。结果阿卡宁在含尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)的HLM孵育中,可以检测到1个UGT代谢产物。UGT单酶筛选发现UGT1A9高选择性催化阿卡宁。酶动力学研究显示在HLM、HKM和UGT1A9中阿卡宁的UGT代谢都呈底物抑制模式,并且表观亲和常数(Km)在3.75~4.50μmol/L。阿卡宁和已知UGT1A9探针底物异丙酚在12例个体人肝中的UGT代谢具有很好的相关性,R2为0.88。化学抑制实验显示在HLM中,厚朴酚和尼氟灭酸对阿卡宁的UGT代谢具有明显的抑制作用;睾酮、雷公藤红素和尼罗替尼对阿卡宁的UGT代谢均无明显抑制作用。结论 UGT代谢是阿卡宁(紫草素)在人体的重要代谢途径之一,阿卡宁是人类UGT1A9的一个高选择性探针底物。     

基于系统药理学方法筛选抗急性髓系白血病的中药活性分子

目的:筛选抗急性髓系白血病(AML)中药活性分子。方法:搜集治疗急白草药及化合物,通过系统药理学方法预测药物成药性质,潜在靶点以及潜在巯基消耗特性。选择口服生物利用度、类药性和巯基消耗活性较高的紫草素作为验证分子。构建潜在活性化合物-靶点、靶点-疾病网络,通过拓扑学特性筛选关键靶点及潜在活性分子。利用谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒及邻苯二甲醛(OPA)荧光法检测加入紫草素后还原型GSH含量变化。数字表达谱芯片检测紫草素100μg·L-1处理HL-60细胞48 h后基因表达。结果:在治疗AML的40味草药的4 024个化合物中,经过口服生物利用度(OB),类药性(drug-likeness,DL)及巯基消耗特性筛选获得72个分子,最后通过与AML相关靶点联系筛选出10个潜在活性化合物。实验验证紫草素消耗细胞及化学体系内GSH,预测靶点能够调控基因芯片的差异基因(100μg·L-1,48 h)。结论:本方法可用于研究中药的物质基础,有助于挖掘治疗AML中药活性分子,为抗AML药物研究提供借鉴。     

基于Keap1/Nrf2通路介导的自噬探讨紫草素对膀胱上皮癌BUC细胞化疗敏感性的影响

目的基于Kelch样ECH相关蛋白1/核因子E2相关因子2(Kelch-likeECH-associated protein-1/nuclearfactor E2-related factor 2,Keap1/Nrf2)通路介导的自噬探讨紫草素对膀胱上皮癌BUC细胞化疗敏感性的影响。方法体外培养人BUC细胞BIU-87,CCK-8法检测不同质量浓度(10、20、40、80、160μg/mL)顺铂和不同浓度(2、4、8、16、32μmol/L)紫草素+顺铂(40μg/mL)对BIU-87细胞增殖的影响。细胞转染实验,设置对照组、顺铂组(40μg/mL)、紫草素组(40μg/mL顺铂+8μmol/L紫草素)和NC组(转染negative control-Nrf2+40μg/mL顺铂+8μmol/L紫草素)和Nrf2组(转染hsa-Nrf2mimic+40μg/mL顺铂+8μmol/L紫草素),实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法检测转染后BIU-87细胞中Nrf2 mRNA表达情况;CCK-8法检测各组BIU-87细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组BIU-87细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测BIU-87细胞中Keap1、Nrf2、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)?、LC3II蛋白表达情况。结果与对照组相比,10、20、40、80、160μg/mL顺铂可显著抑制BIU-87细胞增殖(P0.05);2、4、8、16、32μmol/L紫草素联合顺铂可显著抑制BIU-87细胞增殖(P0.05)。细胞转染实验中,与对照组相比,顺铂组BIU-87细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Nrf2和LC3II蛋白表达水平显著升高,细胞中Keap1、LC3?蛋白表达水平显著降低(P0.05);与顺铂组相比,紫草素组BIU-87细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Keap1和LC3?蛋白表达水平显著升高,Nrf2和LC3II蛋白表达水平显著降低(P0.05);紫草素组、NC组以上指标差异不具有统计学意义(P0.05);与NC组相比,Nrf2组BIU-87细胞增殖抑制率、凋亡率、细胞中Keap1、LC3?蛋白表达水平显著降低,Nrf2蛋白和mR NA及LC3II蛋白表达水平显著升高(P0.05)。结论紫草素可能通过抑制Keap1/Nrf2通路介导的自噬反应,增强BUC细胞BIU-87对顺铂的敏感性。