嵌合抗原受体修饰的CD19-CAR-T的体外构建、扩增及初步功能鉴定

目的： 探索一种特异性靶向 CD19 分子的嵌合抗原受体修饰的 CD19-CAR-T 的构建方法,并明确其体外杀伤 靶细胞的效果。 方法： 运用分子克隆技术,将 PCR 获得的 CD19-CAR 片段构建到 pCDH-GFP 慢病毒载体上,利用包装 的慢病毒颗粒转染供者 CD3 + T 细胞,通过流式细胞术及 PCR鉴定转染效率,并通过 7-AAD染色鉴定扩增得到的CD19- CAR-T细胞体外杀伤CD19 + Ramos靶细胞的效果。 结果： 经慢病毒转染T细胞在体外培养 10 d 后,CD3 + T 扩增达（78.8± 23.2）倍, （58.3±5.4）%的 CD3 + T 细胞表达 GFP,CD19-CAR-T 体外杀伤 CD19 + Ramos 靶细胞在效靶比5∶1时效率为（57.4± 9.3）%。 结论： 本实验成功建立了一种有效的体外构建及扩增CD19-CAR-T的方法,且具有明显靶向性,为CD19 + B细胞肿瘤临 床治疗提供实验依据。     

一种带有组氨酸标签的抗糖尿病疫苗的构建、表达、纯化及鉴定

利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277。通过乳糖诱导,融合蛋白HIS-HSP65-6P277在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中以可溶形式表达,镍柱亲和层析纯化后,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明表达产物是约70 k具有6个组氨酸标签肽的融合蛋白;分离纯化融合蛋白的时间从原来的15～20 d缩短为2～3 d,产量提高到56 mg/L。组氨酸标签系统可以较好的简化抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的纯化工艺,提高产量。     

肿瘤细胞裂解物疫苗与其修饰的树突状细胞联合抗A20鼠淋巴瘤的作用

将A20淋巴瘤细胞,反复冻融,获得肿瘤细胞裂解物的抗原肽,以来源于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)热休克蛋白70(HSP70)第407-426(mHSP70407~426,M)的两段串联重复序列M2小肽为佐剂,通过双功能偶联试剂戊二醛偶联制备肿瘤细胞疫苗A20-M2,偶联产物在体外修饰未成熟的DC,通过检测负载肿瘤细胞抗原的DC细胞分泌的细胞因子以及抗原来确定被修饰DC细胞的成熟度,获得成熟DC即获得DC疫苗。用A20-M2与DC两种疫苗联合给药治疗小鼠,实验结果显示,激发的免疫应答对于A20肿瘤攻击起到有效的保护作用,与PBS阴性对照组比较,平均肿瘤重显著降低(P<0.01),通过ELISA法,从小鼠血清中检测到高滴度抗细胞裂解物类抗体,淋巴细胞增殖试验显示疫苗联合给药后能够有效的刺激脾淋巴细胞的增殖反应。A20-M2能够有效的刺激DC细胞成熟,A20-M2与成熟DC细胞联合给药能够有效的抑制小鼠A20淋巴瘤的生长。     

MiR-217对小鼠胰腺成体干细胞增殖的调控作用

为了进一步研究miR-217在小鼠胰腺成体干细胞生长过程中的调控作用,在培养的胰腺成体干细胞中过表达miR-217,用Western blot和免疫荧光的方法检测miR-217对细胞增殖的影响。结果显示,miR-217能够明显抑制胰腺成体干细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Ki-67的表达。使用生物信息学软件预测miR-217的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因的方法验证了miR-217对靶点的靶向性,实验结果表明,miR-217能够抑制PMIR-REPORT-Sirt1-3′UTR荧光素酶活性。进一步在二维培养的胰腺成体干细胞中,过表达miR-217检测Sirt1的表达变化,qPCR和Western blot表明在胰腺成体干细胞中miR-217能够抑制Sirt1的蛋白水平的表达,但对mRNA水平没有影响。在胰腺成体干细胞中分别加入Sirt1的抑制剂尼克酰胺和激动剂白藜芦醇,尼克酰胺能够抑制胰腺成体干细胞的增殖,而白藜芦醇促进了胰腺成体干细胞的增殖。以上结果说明,miR-217通过Sirt1调控胰腺成体干细胞的生长,低表达的miR-217有助于维持胰腺成体干细胞的增殖。     

人源血管内皮生长因子突变体Ⅱ的克隆表达、分离纯化及初步鉴定

构建人源血管内皮生长因子突变体hVEGF121Ⅱ的重组原核表达质粒,获得hVEGF121Ⅱ蛋白用于制备抗血管生成作用更强的抗肿瘤疫苗。利用PCR技术,在已构建的hVEGF121Ⅰ突变体的基因末端引入热休克蛋白mHSP70的407-426两段串联重复序列的编码基因,PCR产物经Hind III和Nco I双酶切后连接到经同样限制性内切酶切过的原核表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,乳糖诱导表达,超声破碎菌体,包涵体经洗涤、溶解、稀释复性、离子交换层析得到目的蛋白hVEGF121Ⅱ,Western-blot鉴定。结果成功构建了hVEGF121Ⅱ蛋白的表达质粒pET-28a(+)-hVEGF121Ⅱ,重组菌株经乳糖诱导后,目的蛋白表达量占全菌蛋白的62%,分离纯化后纯度达到95%,hVEGF121Ⅱ蛋白的单体和二聚体都可以和VEGF抗体结合。重组hVEGF121Ⅱ蛋白的表达成功为进一步对其进行免疫学研究奠定了基础。     

菊欧氏杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

以菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因及其调控元件并克隆至pUC19载体。测序结果经分析,该基因编码的蛋白序列与菊欧氏杆菌Ech586的β-1,4-内切葡聚糖酶同源性达到98%。将celY的开放阅读框基因插入到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),采用LB-CMC平板刚果红染色筛选含celY基因的转化子。12%SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。CMCase活力测定显示重组pET-28a-celY阳性菌分泌到培养基中的CelY酶活力为84.4 U/L,周质中的酶活力为12.7 U/L。β-1,4-内切葡聚糖酶CelY工程菌的获得,为研究菊欧氏杆菌纤维素酶基因在菊欧氏杆菌同源转化中的表达及工程菌的酶学特性提供了重要的资料。     

重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定

利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶(L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化入BL21(DE3)。乳糖诱导使其表达,其中80%以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质。将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95%以上。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性。