半胱氨酰白三烯受体2通过介导小胶质细胞激活诱导缺血性神经元损伤

目的探索半胱氨酰白三烯(CysLT)受体在大鼠皮层神经元缺氧缺糖损伤中的调节作用及作用机制。方法培养大鼠原代皮层神经元或大鼠原代皮层混合培养细胞,以缺糖缺氧(OGD)模拟脑缺血损伤,以MTT还原法/LDH释放检测确定神经元存活/损伤,以免疫组化做神经元(抗MAP2)、星形胶质细胞(抗GFAP)、小胶质细胞(抗Iba1)特异性染色,观察各细胞数量变化,以PI/Hoechst染色确定细胞凋亡/坏死。以受体激动剂LTD4,NMLTC4,CysLT1拮抗剂孟鲁司特、CysLT2拮抗剂HAMI3379/CysLT1-siRNA及CysLT2-shRNA为药理学干预/基因干扰工具。结果 LTD4(0.1～1000 nmol·L-1),NMLTC4(0.1～1000 nnmol·L-1)不能诱导单纯神经元损伤;CysLT1-siRNA及CysLT2-shRNA不能减轻OGD诱导的神经元损伤;LTD4(1～1000 nnmol·L-1),NMLTC4(0.1～1000 nnmol·L-1)能诱导皮层混合细胞损伤;HAMI3379(0.001～1μmol·L-1)和CysLT2-shRNA能减轻OGD,LTD4或NMLTC4诱导的皮层混合细胞损伤及其诱导的小胶质细胞激活,CysLT1-siRNA无此作用。结论 CysLT2受体可能参与OGD诱导神经元损伤的调节,CysLT2拮抗剂可通过减轻小胶质细胞激活而减轻OGD诱导的神经元损伤。     

半胱氨酰白三烯受体2拮抗剂筛选方法的建立及化合物初筛

目的:建立半胱氨酰白三烯受体2(CysLT_2受体)拮抗剂筛选的细胞模型及方法,初筛系列合成化合物.方法:选用高表达CysLT_2受体的大鼠C6胶质瘤细胞,激动剂LTD_4攻击后检测细胞内钙浓度变化,作为CysLT_2受体拮抗剂的筛选方法,初步筛选有拮抗剂活性的化合物.采用CysLT1/CysLT_2受体非选择性拮抗剂Bay u9773和CysLT_2受体选择性拮抗剂AP-100984作为参照.结果:RT-PCR鉴定表明C6细胞高表达CysLT_2受体.LTD_4 1 μmol/L能显著升高C6细胞内钙,其作用约为阳性对照ATP的37 5%.CysLT_2受体拮抗剂抑制LTD_4诱导的C6细胞内钙升高,CysLT_1受体选择性拮抗剂无抑制作用.化合物中DXW-1、2、13、23、29、30能抑制LTD_4诱导的细胞内钙升高.结论:LTD_4诱导的C6细胞的钙信号变化可作为CysLT_2受体拮抗剂的筛选方法;化合物DXW-1、2、13、23、29、30具有CysLT_2受体拮抗活性.     

重组人尼克酰胺磷酸核糖转移酶及其活性位点突变体蛋白的制备及体外酶活性检测

目的:制备和纯化重组人NAMPT和NAMPT(H247A)蛋白,并对其体外酶活性进行检测。方法:以pcDNA3.1-hnampt为模板,通过PCR扩增获得两端分别为BamHⅠ和NdeⅠ酶切位点的hnampt片断,将该片断与pET-11a(+)表达型载体连接,通过点突变获得pET-11a(+)-hnampt(H247A),以测序鉴定构建质粒。将野生型和突变型分别转化至BL21star大肠杆菌,以IPTG诱导蛋白表达,以镍柱和分子筛纯化目标蛋白,以SDS凝胶电泳和质谱鉴定目标蛋白,以核磁共振的方法检测两个重组蛋白在体外酶活性。结果:测序结果表明,pET-11a(+)-hnampt(野生型)及pET-11a(+)-hnampt(H247A)(突变型)表达载体构建成功,突变位点正确。两种蛋白均在BL21star大肠杆菌获得表达,裂解后为可溶性蛋白,通过镍柱、分子筛获得纯化蛋白,SDS凝胶电泳和质谱鉴定证明重组蛋白为分子量约56 kD的NAMPT。核磁共振体外酶活性检测发现野生型NAMPT具有酶活性,而NAMPT(H247A)的酶活性降低了约5～10倍。结论:成功获得了有体外酶活性的人NAMPT蛋白和酶活性较低的人NA...     

P2Y样G蛋白偶联受体GPR17参与缺糖缺氧诱导BV2小胶质细胞激活

目的探讨P2Y样G蛋白偶联受体GPR17是否参与缺糖缺氧/恢复(OGD/R)诱导BV2小胶质细胞的激活。方法以OGD诱导BV2小胶质细胞激活,以MTT还原法检测细胞活性,以Western blotting和免疫细胞化学方法观察OGD/R后GPR17表达分布变化,以GPR17 siRNA沉默GPR17的表达,以RT-PCR检测GPR17敲低对OGD/R诱导的细胞因子表达的影响。结果 OGD 1 h后,BV2细胞形态由正常分支状变为阿米巴状,表明OGD可诱导细胞激活;Western blotting显示GPR17的蛋白表达随着OGD后恢复时间的延长而明显上调;免疫组化显示正常状态下GPR17主要表达在BV2细胞膜上,OGD/R后GPR17发生核移位;RT-PCR显示OGD/R后iNOS和IL-1β的mRNA水平明显升高;GPR17敲低可显著抑制OGD诱导的BV2细胞激活以及OGD 1 h/R 48 h后的细胞增殖和iNOS的mRNA合成。结论 GPR17参与缺糖缺氧诱导BV2小胶质细胞的激活。     

半胱氨酰白三烯受体1参与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的调节

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1(CysLT1受体)与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的关系.方法:鱼藤酮及CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特处理PC12细胞后,以MTT方法检测PC12细胞活性变化;以Western blotting检测鱼藤酮处理前后,PC12细胞CysLT1受体的表达变化;不同浓度鱼藤酮处理24 h及3μmol/L鱼藤酮处理不同时间,以免疫细胞化学方法观察CysLT1受体分布变化.结果:鱼藤酮(0.3 ～30 μmol/L)可诱导PC12细胞损伤,孟鲁司特(1、5μmol/L)可显著减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤.1～ 10 μnol/L鱼藤酮作用PC12细胞24 h及3μmol/L鱼藤酮处理3h和24 h,均可诱导CysLT1受体蛋白水平表达升高.鱼藤酮能浓度和时间依赖性引起CysLT1受体从细胞核移位到细胞浆.结论:CysLT1受体参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤.     

新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体制备及其鉴定

目的：制备新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体（pAb），并鉴定其免疫学特性。方法：以KLH偶联的GPR17多肽免疫家兔制备其pAb，用间接ELISA法测定抗体效价，阻断ELISA测定抗体敏感性及特异性，同时以新制备的抗体做Westernblot，检测GPR17的组织表达。结果：通过免疫家兔获得的抗GPR17pAb，ELISA测定显示其抗体效价最高可达到1／16364，并对CysLT1受体和CysLT2受体基本无交叉反应，具有较好的特异性。Westernblot结果显示，GPR17在大鼠脑和心脏组织中有较高的表达，其分子量在43kD左右。结论：制备的GPR17pAb具有较高的效价和较好的特异性，能满足Westernblot检测GPR17的要求。     

咯利普兰逆转豚鼠离体气管对沙丁胺醇的耐受性

本研究目的旨在观察PDEIV抑制剂咯利普兰对沙丁胺醇(SB)耐受性的影响。用豚鼠离体气管标本,预先接触SB1μmol·L^-1,1h可使SB对抗乙酰甲胆碱气管收缩作用的剂量反应曲线右移5倍,最大松弛率下降30%,形成SB气管松弛作用的耐受性。磷酸二酯酶(PDE)IV抑制剂咯利普兰能翻转SB气管松弛作用的耐受性,但PDEII抑制剂氰胍哒嗪则不能。虽然蛋白合成抑制剂环己酰亚胺对SB耐受性无预防作用,但上述结果仍提示SB气管松弛作用的耐受性可能与PDEIV活性的增高有关。     

磷脂酶D在脂多糖及抗原引爆大鼠外周血白细胞中的作用

目的 :探讨脂多糖 (L PS)与卵白蛋白 (OA)是否引爆大鼠外周血白细胞 ,致敏过程对大鼠外周血白细胞引爆的影响以及磷脂酶 D在大鼠外周血白细胞引爆中的作用。方法 :采用正常及主动致敏的大鼠外周血白细胞为实验材料 ,以 L PS或抗原 (OA)为引爆剂 ,f MLP为激动剂处理细胞 ,测定白细胞弹性蛋白酶释放和髓过氧化物酶(MPO)活性作为细胞激活指标 ,同时 ,用酶偶联比色法测定白细胞 PL D活性。结果 :LPS和 f ML P共同处理正常大鼠外周血白细胞 ,引起弹性蛋白酶和 MPO释放高于 f ML P单独处理 (P<0 .0 5 ) ;OA和 f ML P共同处理正常大鼠外周血白细胞 ,引起上述两种酶的释放与 f MLP单独处理无明显差别。 LPS和 f MLP共同作用于致敏大鼠外周血白细胞 ,引起弹性蛋白酶和 MPO释放与 f MLP单独作用无明显差别 ;OA和 f ML P共同作用于致敏大鼠外周血白细胞 ,引起上述两种酶的释放高于 f MLP单独作用 (P<0 .0 5 )。正常大鼠中 ,PLD活性与弹性蛋白酶释放和 MPO活性的相关系数 ,分别为 0 .5 1和 0 .73(P<0 .0 1)。致敏大鼠中 ,PLD活性与弹性蛋白酶释放和 MPO活性的相关系数 ,分别为 0 .4 8(P<0 .0 1)和 0 .37(P<0 .0 5 )。结论 :1LPS能引爆正常大鼠外周血白细胞。 2特异性抗原 OA能引爆致敏大鼠外周血白细胞。 3PLD与大鼠     

甲泼尼龙与抑肽酶对心肺转流术致全身炎症反应过程中白细胞磷脂酶D活性的影响

目的:探讨白细胞磷脂酶D(PLD)在心肺转流术(CPB)致全身性炎症反应过程中的作用及甲泼尼龙和抑肽酶对PLD活性的影响。方法:42例接受CPB心脏直视手术病人,分为对照组、甲泼尼龙组和抑肽酶组,患者于术前、心肺转流术中及术后8个不同时点采集动脉血,测定白细胞PLD活性,并检测髓过氧化物酶活性、CD11b表达及血浆IL-6、IL-8和C-反应蛋白的含量。结果:在升主动脉开放时点,对照组白细胞PLD活性为(18±8)nmol choline·h~(-1)·mg~(-1),明显高于术前;甲泼尼龙组为(10±6)nmol choline·h~(-1)·mg~(-1),明显低于对照组,但与术前相比差别无显著意义;甲泼尼龙组白细胞PLD活性升高时点后移至停CPB即刻点;抑肽酶组PLD活性与对照组相比差别无显著意义;但两药均不同程度降低CPB围术期血浆中IL-6、IL-8和C-反应蛋白水平及MRO活性、白细胞CD11b表达。结论:CPB致全身炎症反应过程中白细胞的PLD活性持续升高;甲泼尼龙部分抑制CPB引起的炎症反应,其抗炎机制与抑制PLD有关。     

依达拉奉抗神经元缺血性损伤作用的内环境影响因素

目的：观察内环境因素（pH和甘氨酸及离子浓度）对依达拉奉抗神经元缺血性损伤作用的影响。方法：大鼠原代培养皮质神经元，在不同的实验溶液（模拟缺血后脑内环境的变化）以缺氧缺糖（oxygen-glucosed eprivation，OGD）3h和再灌12h诱导皮质神经元损伤，以噻唑蓝（MTT）还原反应和乳酸脱氢酶（LDH）释放观察损伤变化。观察不同实验溶液对抗脑缺血药物依达拉奉抗缺血性损伤作用的影响。结果：在弱碱性（pH7．8）或含甘氨酸（10μmol／L）的实验溶液中，OGD损伤加重；在弱酸性（pH6．5）或高Mg^2＋（1．8mmol／L）条件下，OGD损伤减轻。依达拉奉（1μmol／L）能逆转在pH6．1、7．4、7．8或含甘氨酸溶液中OGD损伤；而对pH6．5、高Mg^2＋或低Ca^2＋溶液中的OGD损伤未显示保护作用。结论：内环境因素改变可影响缺血性损伤程度和依达拉奉抗损伤作用。