orchinol对胃癌SGC-7901细胞侵袭迁移和Wnt3a/β-catenin信号通路的影响

研究中药绶草中分离得到的主要的9,10-二氢菲类单体化合物orchinol对人胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的抑制作用及初步的分子机制。体外培养人胃癌SGC-7901细胞,分别加入终浓度为5,10,20,40,80μmol·L-1的orchinol处理细胞24,48,72 h,采用MTT法检测orchinol对SGC-7901细胞活力的影响;利用伤口愈合实验、Transwell实验分别分析5,10,20μmol·L^-1orchinol作用48 h后对SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力的影响;Western blot法检测orchinol对SGC-7901细胞β-catenin,Wnt-3a,DvL2,cyclinD1,GSK-3β蛋白表达水平的影响。结果显示,orchinol在5~80μmol·L^-1能以剂量和时间依赖性的方式抑制SGC-7901细胞的活力,orchinol分别处理细胞24,48,72 h后,其对SGC-7901细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为77.79,42.96,7.85μmol·L^-1;与对照组相比,5,10,20μmol·L^-1orchinol作用48 h,可明显抑制SGC-7901细胞侵袭和迁移的能力(P<0.05,P<0.01),且呈剂量依赖关系;Western blot结果显示,orchinol可显著下调β-catenin,Wnt3a,DvL2,cyclinD1蛋白、显著上调GSK-3β蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。以上结果提示orchinol能显著抑制SGC-7901细胞侵袭和迁移能力,其机制可能是与orchinol抑制Wnt3a/β-catenin信号通路及下游基因蛋白的表达有关。     

重组人尼克酰胺磷酸核糖转移酶及其活性位点突变体蛋白的制备及体外酶活性检测

目的:制备和纯化重组人NAMPT和NAMPT(H247A)蛋白,并对其体外酶活性进行检测。方法:以pcDNA3.1-hnampt为模板,通过PCR扩增获得两端分别为BamHⅠ和NdeⅠ酶切位点的hnampt片断,将该片断与pET-11a(+)表达型载体连接,通过点突变获得pET-11a(+)-hnampt(H247A),以测序鉴定构建质粒。将野生型和突变型分别转化至BL21star大肠杆菌,以IPTG诱导蛋白表达,以镍柱和分子筛纯化目标蛋白,以SDS凝胶电泳和质谱鉴定目标蛋白,以核磁共振的方法检测两个重组蛋白在体外酶活性。结果:测序结果表明,pET-11a(+)-hnampt(野生型)及pET-11a(+)-hnampt(H247A)(突变型)表达载体构建成功,突变位点正确。两种蛋白均在BL21star大肠杆菌获得表达,裂解后为可溶性蛋白,通过镍柱、分子筛获得纯化蛋白,SDS凝胶电泳和质谱鉴定证明重组蛋白为分子量约56 kD的NAMPT。核磁共振体外酶活性检测发现野生型NAMPT具有酶活性,而NAMPT(H247A)的酶活性降低了约5～10倍。结论:成功获得了有体外酶活性的人NAMPT蛋白和酶活性较低的人NA...     

斑叶兰化学成分的分离鉴定

目的:对斑叶兰属植物斑叶兰Goodyera schlechtendaliana的化学成分进行分离纯化,从而丰富斑叶兰的化学成分,为斑叶兰后续深入研究奠定基础。方法:取斑叶兰干燥全草10 kg,85℃下用95%乙醇回流提取4次,合并提取液,减压浓缩得到粗浸膏,再将粗浸膏混悬于蒸馏水中,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位。采用硅胶,Sephadex LH-20,ODS等多种色谱填料和半制备高效液相对斑叶兰的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位进行分离和纯化,利用~1H-NMR,~(13)C-NMR,MS等各种现代波谱技术以及化合物的理化性质并结合参考文献确定化合物的化学结构。结果:从斑叶兰乙酸乙酯部位和正丁醇部位分离得到10个化合物,分别是2,5-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲(1),间苯三酚三甲醚(2),3,4-二羟基苯甲酸(3),4-羟基苯甲醛(4),4-羟基苯甲酸(5),槲皮素(6),香兰素(7),胡萝卜苷(8),腺嘌呤(9),腺嘌呤核苷(10)。结论:化合物1～10均为首次从斑叶兰属植物中分离得到。