基因治疗的研究概况

基因治疗是随着对遗传性疾病的认识的深入和分子生物学技术的发展而诞生的。在80年代初期，就提出了基因治疗的模式，即1）基因修正法（GeneCorrection）；2）基因替代法（GeneReplacement）；3）基因加入法（GeneAddition）和4）基因修饰法（GeneActivation）。到90年代，世界首例腺苷脱氨酶（ADA）缺乏性重症联合免疫缺陷病的基因治疗获得成功。到目前为止，已有20多种基因治疗方案开始实施，并取得了一定成绩。本文就基因治疗的三大基本环节研究状况综述如下。1受体细胞的选择基因治疗受体细胞来源十分广泛，不仅局限于当初的只选用…     

VEGF基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:探讨脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCS)应用于基因治疗的可行性、安全性。方法:体外分离、培养、鉴定MSCs,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染MSCs,转染后用免疫荧光和ELISA检测MSCs表达VEGF蛋白的情况,MTT检测MSCs对VEGF质粒转染的敏感性。结果:骨髓中分离得到MSCs,流式细胞检测显示MSCs不表达CD34和CD45,但表达CD90。透射电镜观察可见细胞浆中含大量粗面内质网和分泌颗粒。VEGF基因转染MSCs后第5天抗VEGF免疫荧光染色约90%的MSCs呈阳性,ELISA检测结果显示PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组细胞培养上清液中VEGF含量明显高于对照组,并于转染后第5天达到峰值。MTT检测结果显示VEGF质粒转染对MSCs增殖无影响。结论:MSC可作为VEGF基因转染的靶细胞用于基因治疗。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体对肝细胞肝癌的抑制作用

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体(TRAIL)对肝细胞肝癌的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白融合TRAIL质粒,转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721细胞后,分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测 TRAIL的表达,采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;体内实验建立裸鼠肝癌皮下模型,pIRES-EGFP-TRAIL直接瘤体注射,并观察TRAIL的抑癌作用。结果 真核表达质粒TRAIL体外转染肝癌细胞后,RT-PCR和 Western blot证实了肝癌细胞中有 TRAIL的表达,但对肝癌细胞的生长无显著性的抑制作用。体内直接瘤体注射 pIRES-EGFP-TRAIL 2周,RT-PCR证实瘤体有 TRAIL mRNA强表达,癌旁组织 TRAIL mRNA呈弱表达,正常肝无 TRAIL mRNA表达,但两组间肿瘤大小差异无显著性(P>0.05)。结论 肝细胞肝癌对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象,提示HCC中存在抑制TRAIL诱导凋亡的因素,单一的TRAIL治疗HCC疗效有限。     

勃起功能障碍基因治疗研究进展

近年来基因治疗被尝试用于勃起功能障碍(ED)治疗的动物实验,许多研究发现基因治疗方案对各种类型的ED均有一定的治疗作用。特别是在左旋精氨酸-一氧化氮-环磷酸鸟苷通路、离子通道、勃起神经和海绵体血管内皮细胞的修复保护等方面的基因治疗研究显示,基因治疗ED有一定的疗效。但应用基因治疗来治疗ED患者,目前仍有较多的困难,暂时无法应用于临床。本综述旨在对该领域的最新研究进展做一个简单的介绍和展望。     

BAI1表达抗肠癌组织的血管生成疗法

目的 探讨大肠癌细胞和组织中BAI1基因的表达情况及BAI1对血管生长和肿瘤生长的抑制作用.方法 提取大肠癌细胞总RNA,按RT-PCR试剂盒的步骤反转录成cDNA,PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳分析.BAI1对血管生长和肿瘤生长的抑制作用应用微血管数量(MVQ)和肿瘤移植实验的方法进行.结果 大肠癌细胞、癌组织中大多数BAI1不表达或表达下降,在全部转移的淋巴结中不表达,在小鼠CC95大肠癌细胞移植肿瘤内注射Ad-hBAI1表达载体可以有效的影响肿瘤的血管生成,并抑制肿瘤的生长.结论 BAI1在肠癌细胞、组织及转移的淋巴结表达降低,该BAI1表达载体可抑制肿瘤的新生血管并抑制肿瘤的生长.     

脂质体介导的单纯疱疹胸苷激酶基因在人前列腺癌细胞中的表达

目的：提取并鉴定已构建的EB病毒表达载体pDR2-TK，利用脂质体介导的基因转染技术将pDR2-TK转染人前列腺癌细胞并对单纯疱疹胸苷激酶（HSV－TK）表达状况进行检测。方法：采用DNA大量制备及纯化系统提取pDR2-TK，酶切和DNA测序进行鉴定，采用阳离子脂质体法将pDR2-TK导入激素非依赖性人前列腺癌细胞系PC－3m，逆转录PCR（RT－PCR）法和SABC免疫组化法检测TK mRNA和蛋白的表达。结果：扩增提取的质粒经PstⅠ和EcoR Ⅴ酶切后各获得4个及2个片段，与原基因酶切图谱一致；所提取质粒PCR产物经DNA测序，与NCBI公布的HSV－TK基因序列对照，证实所提取质粒含目的基因序,旨质体法转染PC－3m细胞后，mRNA和蛋白均有HSV－TK的表达，其蛋白表达率约为22％。结论：pDR2-TK质粒含有目的的基因HSV－TK，阳离子脂质体法可将pDR2-TK导入人前列腺癌细胞并获得较高效率的表达。     

腺病毒载体介导CTLA4Ig基因治疗小鼠变应性鼻炎

目的 检测CTLA4Ig-重组腺病毒载体（Ad-CTLA4Ig）在变应性鼻炎治疗中的作用。方法 采用卵清蛋白（OVA）致敏和激发诱导小鼠变应性鼻炎。实验组在OVA激发前30min予以Ad-CTA4Ig腹腔注射。未转CTLA4IgcDNA的腺病毒载体（Adv）作对照。比较各组动物鼻部症状和鼻粘膜形态学改变，并采用ELISA法测定血清中OVA－特异性IgE水平。结果 CTLA4Ig重组腺病毒实验组小鼠鼻部症状和鼻粘膜病理改变不明显，并且血清中OVA－特异性IgE水平明显低于对照组（P＜0.05）。结论 Ad-CTLA4Ig可防治小鼠应变性鼻炎的发生，提示CTLA4Ig-重组腺病毒载体有可能运用于临床变应性鼻炎的治疗。     

原发性视网膜色素变性的视网膜移植及基因治疗

视网膜移植是指将同种异体的感光细胞或视网膜色素上皮细胞移植于受体视网膜下腔 ;大量研究证明移植物可对受体视网膜细胞起到营养作用并增加其数量 ,同时视网膜色素变性致病基因的认识逐渐清楚明确 ,可通过补充外源性基因或清除异常基因等方法 ,在基因水平上治疗视网膜色素变性     

细菌内快速构建两种用于肝纤维化基因治疗的重组复制缺陷型腺病毒

目的 :在大肠杆菌内快速构建两种分别含有人肝细胞生长因子 (hepatic growth factor,HGF)和非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- type plasm inogen activator,u PA) c DNA片段的重组复制缺陷型腺病毒。方法 :分别将人 HGF和 u PA c DNA片段与穿梭载体 p Track- CMV连接 ,线性化后与骨架载体 Ad Easy- 1在大肠杆菌 BJ5 183内同源重组获得腺病毒载体 p Ad HGF和 p Adu PA,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒 Ad HGF和 Adu PA;将 Ad HGF和 Adu PA分别体外感染肝细胞株 L0 2 ,以 Northern印迹法和 Western印迹法检测两种病毒在肝细胞中的表达。 结果 :连接、重组后通过酶切和测序法筛选出病毒质粒 p Ad HGF和 p Adu PA;经 2 93细胞包装 ,3d后均观察到绿色荧光蛋白明显表达 ,Cs Cl梯度离心纯化最终分别获得 4× 10 1 0 efu/ m l滴度的重组病毒 Ad HGF和 6× 10 1 0 efu/ ml Adu PA;两种病毒体外感染肝细胞 3d后 ,HGF和u PA表达均明显增加。结论 :细菌内同源重组制备复制缺陷型腺病毒 ,纯化过程简单 ,重组腺病毒在肝细胞中均高效表达 ,为肝细胞移植基因治疗肝纤维化提供了新的手段