探针的纯化与否对基因芯片重复利用的影响

目的观察探针的纯度对基因芯片重复利用的影响。方法将探针分为未纯化、纯化两部分并分别与基因芯片杂交,扫描芯片后,用探针剥脱液洗涤芯片;同等条件成像后,进行下一轮杂交。结果未纯化的探针杂交结果背景高,阳性信号界限不清楚;经探针剥脱液洗涤后,仍留有较高强度的背景和原与靶基因片段杂交的阳性信号,即使洗脱4次后,仍有背景和阳性信号存在。纯化的探针杂交结果显示背景低,一般经2次探针剥脱液洗过后,可以完全去除信号并进行下一轮杂交。结论未纯化的探针与基因芯片杂交后,此芯片不能应用于下一轮的杂交;而纯化的探针杂交后,芯片可以再次利用。由此说明探针的纯化是基因芯片重复利用的前提条件。     

仿真技术在基因芯片杂交仪微流路设计中的应用

目的：为了加快基因芯片技术的推广和应用,研制一种集基因芯片清洗、温育、杂交等于一体的新型仪器,使整个过程可在计算机控制下自动完成。方法：借助计算机辅助设计（computeraideddesign,CAD）技术,针对基因杂交仪微流路模块进行建模;借助计算流体力学（computationalfluiddynamics,CFD）技术,应用CFX软件建模分析得到不同流路方式的液流情况;对固架承载结构进行静强度分析,得到其承载分布情况;对电加热模块进行热-固耦合分析,得到微流路模块热应力情况。结果：仿真技术为微流路设计提供了参考和依据,从而更高效地设计出了满足实验流程的基因芯片杂交、清洗微流路模块,避免了结构工艺因素的影响,使得到的实验数据更加科学可信。结论：运用仿真技术完成对微流路模块的设计研究,可以有效地缩短开发周期、节省试验成本,对于该类产品的试制与性能测试具有一定的参考意义。     

3种基于PCR的荧光标记方法的比较研究

目的：荧光标记物是目前杂交型基因芯片所检测的主要目标底物，本实验比较了3种基于PCR的荧光标记方法在基因芯片检测中的应用效果。方法：荧光分子标记的引物或荧光分子修饰的核苷酸可以在PCR反应中通过Taq，Pfu等DNA聚合酶掺入到PCR产物中，在此过程中，荧光分子又可以通过不同的方法掺入到PCR产物中。方法1：直接将荧光分子化学合成在引物的5’端；方法2：在PCR反应体系中加入荧光分子修饰的核苷酸单体，由DNA聚合酶将其掺入PCR产物中；方法3：对PCR产物通过非模板依赖性的酶促加尾反应在其3’端随机加入荧光修饰的核苷酸。本实验优化了3种荧光标记方法，并以检测CYP3A4基因外显子5中4个核苷酸位点的探针微阵列为例，比较了检测效果。结果：在各自优化的实验条件下，从扩增、标记效率以及芯片杂交的信号强度、背景、分辨率等方面进行比较，3种方法得到的荧光标记样品无明显区别，但后两种方法操作过程复杂，使用成本高，对反应条件苛刻。结论：3种基于PCR扩增的荧光标记方法均可以提供优质的荧光标记探针或样品(底物)，在实际应用中，各自有不同的特点及适用范围。     

hHGF调控肝纤维化信号转导途径研究

目的应用寡聚核苷酸基因表达谱芯片研究人肝细胞生长因子(hHGF)转染肝癌细胞系后基因表达谱的差异,分析hHGF抗肝纤维化的信号转导途径。方法应用包含20000条人类全长基因的寡聚核苷酸芯片ImaGene3.0检测hHGF转染的肝癌细胞系基因表达谱差异,并选择其中参与肝纤维化过程的存在表达上调基因[信号转导和转录激活因子1(STAT1)和丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)]用RT-PCR方法进行验证分析。结果基因芯片筛选出存在差异表达的基因,其中包括转录因子、细胞周期素、细胞因子相关蛋白、糖脂类物质代谢相关酶及细胞信号转导相关因子等,RT-PCR验证参与肝纤维化过程中的几种存在表达差异的基因,其中STAT1和MAPK1表达明显上调,与基因芯片分析结果一致。结论hHGF转染肝癌细胞系存在基因表达差异,可能影响细胞周期的调控、物质代谢相关过程及细胞信号转导系统,hHGF可能通过激活JAK/STAT通路和MAPK通路发挥其抗肝纤维化作用。     

HCV基因分型生物芯片探针设计的探讨

目的　探讨适用于临床实验室的丙型肝炎病毒(hepatictisCvirus,HCV)基因分型诊断芯片的探针设计方案。方法　用TaxonomyBrowser和BLAST工具搜索GenBank中所有已登录的HCV序列,用Clustal.W算法进行序列连配与比对,用生物信息学方法获得 5′非编码区(5′UTR)和核心蛋白区(C区)的比对文件,根据探针设计的原则和要求,确定探针在序列中的位置。用Oligo6. 0和PrimerPremier5. 0软件设计探针。设计芯片上 6×6的探针阵列模式。结果　从 778个HCV序列中获得 5′UTR和C区序列变异比对文件,发现 7个存在活跃共突变的区域。根据序列分析数据设计了 5′UTR27个探针和C区 9个探针。设计了由不同的探针组合构成的 33种杂交阵列模式。结论　采用 5′UTR和C区多探针联合检测的基因芯片技术可简化HCV分型方法,提高检测结果的特异性。     

SARS病毒全基因组芯片在临床检测中的应用

目的：利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸，为SARS病毒核酸的诊断提供线索。方法：提取SARS患者血、便和痰样本中的冠状病毒RNA，经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针，与SARS病毒全基因组芯片进行杂交，同时用体外培养的病毒RNA和从健康人分离的白细胞的RNA分别做阳性和阴性对照，杂交后的芯片用Axon4100A扫描仪扫描和分析。结果：SARS患者的3种标本中都能检测到冠状病毒核酸的存在，与整个病毒基因组比较大都为一些不连续的片断。其中痰和便标本中的基因谱较为相似，并且发现编码S1蛋白的核酸在多数痰和便标本中是连续的。结论：冠状病毒全基因组芯片能够检测出SARS患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸，同时能够监测不同样本中该病毒全基因组变化的特点，初步显示该芯片用于临床检测的可行性。     

基因芯片技术检测HBV DNA及拉米夫定耐药株的应用研究

目的 :研究基因芯片技术检测 HBV DNA及拉米夫定耐药株在临床应用中的特异性、实用性。方法 :利用基因芯片法、双脱氧测序法分别对 4 3例服用拉米夫定且 HBV DNA仍为阳性的乙型肝炎 (乙肝 )患者及 10例非乙肝患者的血清进行 HBV DNA和 P区 5 2 8、5 5 2、5 5 5突变位点检测、对比。结果 :两种方法检测 HBV DNA10 0 %相符 ;检测拉米夫定耐药突变株 12 4个位点结果相符 ,5个位点结果不相符 (P >0 .0 5 ) ,提示两种方法检测HBV DNA及 P区 5 2 8、5 5 2、5 5 5突变位点阳性率相等。结论 :利用基因芯片技术检测 HBV DNA及拉米夫定耐药株 ,其特异性可与 DNA测序媲美 ,在混合株检测方面比 DNA测序有更大的优势。其方法简便 ,能大量地对临床标本进行检测 ,可作为临床常规检测手段。     

一种国产基因芯片用于乙型肝炎病毒P基因突变的检测

目的：验证国产基因芯片检测HBV—P基因突变的准确性和敏感性。方法：选择14例服用拉米夫定48周时HBV—DNA定量检测仍阳性的慢性乙型肝炎病人的血清标本，用HBV基因突变检测基因芯片检测患者血清中HBV—DNA聚合酶基因，观察发生YMDD变异的情况。同时用聚合酶链反应(PCR）技术扩增上述血清标本中编码HBV—DNA聚合酶的P基因片段并直接测序，以对比检查P基因发生YMDD变异的情况。结果：14例患者血清标本用基因芯片均检出HBV—DNA，9例为野生株，5例发生YMDD变异，其中3例为M552I(YIDD)变异，2例为M552V(YVDD)变异，同时均伴有L528M变异。与用PCR扩增产物直接测序的结果完全相同。结论：国产HBV基因突变检测芯片具有特异性强、灵敏性高、快速、简便等优点，可以替代繁琐的DNA序列测定和分析，可作为临床监测HBV—DNA变异的常规方法。     

应用高密度基因芯片筛选中枢神经系统发育和损伤相关基因的研究

目的探讨中枢神经系统(CNS)发育、损伤相关基因,为基因工程治疗CNS损伤提供以一些可能的靶基因.方法采用高密度的发育表达谱基因芯片,检测了在视神经发育、损伤共8个不同的时相点上视神经的第一级投射站--外侧膝状体的基因表达情况.结果以正常成年小鼠作为对照,共找到差异表达基因2 041个:高表达(ratio≥2)的基因1 095个,其中在发育期间高表达的基因560个,在损伤后高表达的基因416个,在发育期间和损伤后均有高表达的基因119个;低表达(ratio≤0.5)的基因946个,其中在发育期间低表达的基因275个,在损伤后低表达的基因458个,在发育期间和损伤后均有低表达的基因213个.对高表达的1 095个基因进行了功能检索、分组,共分为转录调节、信号转导、代谢和物质转运等17组,其中在发育阶段数量最多的功能组是转录调节组和信号转导组,在损伤过程数量最多的功能组是代谢组和物质转运组.一些和轴突生长、导向、突触形成相关的基因Efnb3、Ptn、Nrp、Dbn1只在发育期间表达,抑制轴突生长的基因Rtn4只在损伤后表达,一个和神经元的迁移、轴突的生长相关的基因--Mdk在发育和损伤过程中均有高表达.结论上述这些基因可能是视神经发育以及损伤、修复过程中起关键作用的基因.