O139群霍乱弧菌16S rRNA基因分型分析

[目的]研究北京市O139群霍乱弧菌的分子生物学特征。[方法]对北京市1998～2000年的30株O139群霍乱弧菌进行PCR霍乱肠毒素（CT）基因检测,以16SrRNA为探针对菌株DNA进行Southern杂交后对图谱进行核糖体基因（RT）分型分析。[结果]对30株霍乱弧菌RT图谱进行分析,共存在5种16SrRNA核糖体基因型,其中CT阳性的O139群霍乱弧菌为RT1型,CT阴性的O139群霍乱弧菌为RT2-RT5型。[结论]北京市不同年份的O139群霍乱弧菌CT阳性菌株核糖体基因型较为单一,CT阴性菌株基因型具有明显的多样性。提示北京市O139群霍乱弧菌CT阳性菌株和CT阴性菌株遗传发生上相距较远。     

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应（RT—PCR）方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物，利用SYBRGreen染料，建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT—PCR方法，对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT—PCR检测，与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT—PCR方法，根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增；对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增；RT—PCR检测524份河口水体标本的增菌液，与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性，并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT—PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。     

武汉市6起食物中毒副溶血弧菌分子特征研究

目的：了解武汉地区6起食物中毒病原菌副溶血弧菌分子特征。方法：对6起食物中毒共16株分离株进行药敏分析,运用PCR技术进行耐热性溶血毒素基因（tdh）和耐热性溶血毒素相关溶血素基因（trh）检测,并进行肠道细菌重复基因间共同序列PCR（ER IC-PCR）分析。结果：16株副溶血弧菌对第三代头孢和喹诺酮类较敏感,tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR结果显示每起食物中毒菌株亲缘关系非常紧密,有3起属于同一个群,另外2起属于一个群。结论：武汉地区流行的主要副溶血弧菌分子特征为tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR技术是分析副溶血弧菌引起食物中毒菌株非常有效的工具。     

致病性弧菌生态分布调查及环境因素分析

目的通过对508份标本进行致病性弧菌的分离鉴定,调查弧菌的生态分布状况,有效防止食源性疾病的发生。方法对各类标本进行致病性弧菌的分离鉴定,对菌株进行溶血素、霍乱肠毒素测定和药物敏感实验,对环境因素进行分析。结果腹泻病人粪便、海产品、外环境标本致病性弧菌检出率分别为33.57%、11.54%、65.52%,非O1群霍乱弧菌和副溶血弧菌检出率最高。大多数外环境检出的菌株产生霍乱肠毒素。环境因素调查表明,在水温20℃~25℃、水PH值为6.0~7.0时致病性弧菌的检出率最高。结论各类样标本中均广泛存在着多种致病性弧菌,大部分菌株产生溶血毒素和霍乱肠毒素。加强对海产品和外环境水等的监测工作,预防由该群菌引起的人群感染和流行。     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

A marine bioassay test set to assess marine water and sediment quality-its need,the approach and first results

There is a need for establishing a marine bioassay test set to assess marine water and sediment samples in Germany. The selected marine bioassay test set, two tests for the water phase (with the luminescence bacteria Vibrio fischeri and the algae Phaeodactylum tricornutum Bohlin) and a whole sediment test with the marine amphipod Corophium volutator (Pallas) is described and first results are shown.     

多联实时荧光PCR检测几种重要肠道致病菌的实验研究

目的建立一种能同时检测志贺氏菌(Sh)、O139霍乱弧菌(O139VC)和空肠弯曲菌(CJ)的多联实时荧光PCR定量方法。方法根据Sh的ipaH基因序列、O139VC的wbfR基因序列、CJ的c基因序列的开放读码框(orf),分别利用ABI primer experess 2.0和DNAStar中的Primer Select软件设计出数对特异性的引物和探针,筛选出最佳的各组引物和探针组合,对引物、探针的浓度、Mg2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化,从而建立了检测临床标本中Sh、O139VC和CJ的多联荧光PCR反应体系和检测方法。结果实验显示该方法具有特异性强,灵敏度高,均达到100copies/ml。结论多联实时荧光PCR方法可同时定量地检测临床标本中Sh、O139VC、CJ,结果显示快速简便,准确高效,有利于上述病原菌所致疾病的早期诊断和治疗。     

大蒜液杀灭副溶血弧菌效果及影响因素的试验研究

目的观察大蒜液对副溶血弧菌的杀灭效果及其影响因素。方法应用悬液定量杀菌试验观察大蒜液对副溶血弧菌的杀灭作用及温度、pH、有机物对杀菌效果的影响。结果大蒜液对副溶血弧菌作用30 min,杀灭率为100%;大蒜液室温存放时间<4 h对其杀菌率无影响(P>0.05)、存放>8 h杀菌率明显下降;杀菌作用随温度升高、pH降低而增强,因有机物存在而明显减弱。结论大蒜液可杀灭悬液中副溶血弧菌,杀菌效果受大蒜液存放时间、悬液温度、pH、有机物存在的影响。     

多重PCR检测霍乱弧菌RTX毒力基因

目的：探索建立一种快速、敏感的诊断方法，用于检测霍乱弧菌RTX毒力基因。方法：针对霍乱弧菌霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）、RTX毒素家族的细胞毒素基因（rtxA）和毒素激活子基因（rtxC）分别设计3对引物，建立多重PCR方法；用Hep-2细胞测毒方法检测rtxA、rtxC阳性菌株毒素的表达。结果：所有183株临床和环境中分离的霍乱弧菌中，PCR和Hep-2细胞测毒法RTX毒素均为阳性，而古典生物型标准株（569B）二者均为阴性。结论：该方法快速、特异、敏感，具有较大的应用价值。     

入境船舶饮用水致病性孤菌污染与相关因素

目的：了解珠海口岸入境船舶上饮用水中致病性弧菌污染状况，以及其与船舶卫生管理和卫生处理措施等方面的关系，为检验检疫执法工作和政策的制定提供依据。方法：采集珠海港入境船舶饮用水，对水样进行弧菌科的分离鉴定，并对调查资料进行统计和分析。结果：入境船舶上的饮用水34份，9份检出致病性弧菌，检出率26．47％；检出6种致病性弧菌；船舶卫生状况不同时，其饮用水中致病性弧菌检出率差异有显著性。结论：入境船舶上的饮用水被致病性弧菌污染较严重。有“海水化淡”设备的船舶，可能对降低其饮用水中致病性弧菌检出率有一定作用。建议对入境船舶饮用水的排放加强管理，制定有效的检疫监管措施。