EC9706细胞和人食管鳞状细胞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化状态

目的:探讨人食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)MAL基因启动子区的甲基化状态。方法:利用亚硫酸氢盐测序法检测人食管鳞癌细胞系EC9706中MAL基因启动子区CpG位点甲基化的发生情况。根据测序结果选用甲基化敏感性限制性内切酶酶切结合PCR技术进一步检测26例食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织MAL基因启动子区的甲基化情况。结果:EC9706细胞中MAL基因启动子区检测出42个胞嘧啶位点的甲基化,占所有CpG位点的73.7%(42/57)。食管鳞癌组织中MAL基因的甲基化率为53.8%(14/26),远远高于配对癌旁正常组织的7.7%(2/26)(χ2=10.924,P<0.001)。不同临床病理特征食管鳞癌组织中MAL基因启动子区甲基化率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:MAL基因启动子区的甲基化可能是食管鳞癌发生的机制之一。     

In Situ PLA技术原位分析MTA1与NuRD复合体其他组分的相互作用

目的原位检测肿瘤转移相关蛋白MTA1与NuRD复合体其他组分-Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用并分析MTA1/NuRD复合体在HCT116细胞中的分布情况。方法首先利用co-IP技术体外验证MTA1与NuRD复合体其他组分Mi2、HDAC2及MBD3在HCT116细胞裂解液中的相互作用。然后利用In Situ PLA技术,体内原位检测MTA1与三者的相互作用,并根据镜下阳性荧光信号数目,比较MTA1与Mi2、HDAC2及MBD3之间的作用强弱;根据相互作用位点的亚细胞分布情况,分析间期及M期MTA1/NuRD复合体的核质分布情况。结果首次从体内原位水平证实MTA1与NuRD复合体其他组分-Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用;其作用强度HDAC2最高,Mi2次之,MBD3最弱;首次发现MTA1/NuRD复合体存在很明显的胞质分布（约占总量的1/4）;另外,我们还首次发现在M期MTA1/NuRD复合体不再位于核区,而是位于染色体外周。结论In Situ PLA技术是一项有效的原位检测蛋白相互作用的新技术;MTA1/NuRD复合体可能参与MTA1胞质中功能的发挥;并且其胞质分布可能参与M期进程调控。     

单克隆抗体16 D3抑制肺癌的功能研究

目的分析抗肺癌单克隆抗体16 D3靶抗原蛋白在人肺癌细胞及组织中的表达,鉴定16 D3对肺癌的体内外抑制功能,为肺癌靶向治疗提供候选抗体药物。方法采用免疫组化分析16 D3靶蛋白在人肺癌组织中的表达;采用细胞免疫荧光检测单克隆抗体16 D3识别的抗原在肺癌细胞中的表达及亚细胞定位;共接种移植瘤模型评估16D3对肺癌生长的抑制作用,Transwell法和CCK-8法检测单抗16D3对人肺癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响;采用流式细胞术检测16 D3靶蛋白分别在亲本和sphere培养的人肺癌细胞中的表达。结果单克隆抗体16 D3的靶蛋白在7种人肺癌细胞的胞内及胞膜上均有表达,在76.9％人肺癌患者组织中特异上调表达。该单抗在体内能较显著地抑制人肺腺癌GLC-82的生长,抑制率为58.23％（ P＜0.05）。在体外对该细胞的增殖、迁移和侵袭具有一定的抑制作用,抑制率分别为26.91％、24.23％和23.67％。该单抗的靶蛋白膜表达阳性细胞比例经sphere培养后显著上升。结论单抗16D3靶抗原在人肺癌中特异表达,并可被sphere培养富集。单抗16D3在体外具有多种抑制功能,在体内能显著抑制人肺腺癌生长,可能是一个肺癌靶向治疗的潜在新药。     

医用回旋加速器Saturated Yields参数选择的实验研究校正时

【摘要】目的医用回旋加速器的活度指示校正是针对SaturatedYields进行校正,使其可以准确显示所生产药物的活度,以免造成不必要的资源浪费,因此对SaturatedYields进行校正时参数的选择显得至关重要。方法为了选择合理的参数对SaturatedYields进行校正,本研究以生产合成18F-氟脱氧葡萄糖（18F-FDG）为例,分别采用150、300、600、750、900、1200、1500μA·min进行药物合成,测量最终18F-FDG的产量;并分别对SaturatedYields进行校正,比较理论计算值和实际测量值的区别,从而找出对SaturatedYields进行校正时的合理参数。结果在300～900μA·min之间,正电子药物产量实际测量值和理论计算值呈现良好的线性关系;但是在低于300μA·min或者大于900μA·min时,并不呈现良好的线性关系。结论选择合理的参数,一般在300～900μA·min之间（粒子束流15～30μA,轰击时间20～60min）,对SaturatedYields进行校正,可以使回旋加速器准确显示所生产药物的活度,降低运行成本,减少对工作人员的辐射;而对于选择小于300μA·min或大于900μA·min的参数进行校正时,不仅会造成资源浪费,而且会增加对工作人员的辐射,因此不建议使用其对SaturatedYields进行校正。     

噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.     

食管鳞癌组织中14-3-3ε表达与临床病理因素及预后的相关性

目的 研究14-3-3ε在食管鳞癌及正常食管黏膜中的表达及其临床意义.方法 免疫组化检测72例食管鳞癌及其配对癌旁正常食管黏膜的14-3-3ε表达水平.运用X2检验分析肿瘤组织14-3-3ε表达与临床病理因素的关系.运用Kaplan-Meier法分析肿瘤组织14-3-3ε与患者术后总生存时间的关系.结果 14-3-3ε在食管鳞癌中阳性率和强阳性率分别为77.8%和27.8%;在正常食管黏膜中表达阳性率和强阳性率分别为43.1%和2.8%,其肿瘤高表达差异有统计学意义(P＜0.01).在56例14-3-3ε阳性的肿瘤中,37例(66.1%)为细胞质表达,4(7.1%)例为核表达,15例(26.8%)为质核共表达;在31例14-3-3ε阳性的正常食管黏膜中,无细胞质表达,13例(41.9%)为细胞核表达,18例(58.1%)为质核共表达.该蛋白在肿瘤细胞与正常细胞的定位差异有统计学意义(P＜0.01).通过与临床病理因素的进一步分析,发现肿瘤细胞14-3-3ε表达强阳性与淋巴结转移(P=0.028)和术后5年生存率相关(P=0.018).生存曲线提示肿瘤14-3-3ε强阳性患者预后不良(Log-rank,P=0.031).14-3-3e定位差异与各临床病理因素及术后生存无显著相关性.结论 14-3-3ε在食管癌中表达上调;该蛋白在肿瘤中多表达于细胞质,在正常食管黏膜中多表达于细胞核;14-3-3ε表达水平与淋巴结转移和预后不良呈正相关.

Abstract：

.Objective To investigate the expression of 14-3-3ε in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and relationship of 14-3-3ε and clinicopathological factors of ECSS patients. Methods The 14-3-3ε expression in tumors and adjacent normal epithelia from 72 ESCC patients was detected by immunohistochemical staining. Correlations of 14-3-3ε expression or their subcellular localization and clinicopathological factors were analyzed using Chi-squared test. Survival curves were generated according to the Kaplan-Meier method, and the statistical analysis was performed by Log-rank test. Results The expression of 14-3-3ε protein was significantly up-regulated in tumors with 77. 8% positive and 27. 8%strong positive staining, compared with paired adjacent normal epithelia with 43. 1% positive and only 2. 8%strong positive staining (P ＜ 0. 01 ). In a total of 56 positive staining tumors, 14-3-3ε was detected in cytoplasm of 37 (66. 1% ), in nucleus of 4 (7. 1% ) ,in both cytoplasm and nucleus of 15 (26. 8% ) cases.Whereas, in a total of 31 positive staining normal epithelia, 14-3-3ε was detected in cytoplasm of 0, in nucleus of 13 (41.9%), in both cytoplasm and nucleus of 18 ( 58. 1% ) cases ( P ＜ 0. 01 ). Statistical analysis revealed that strong 14-3-3ε expression was correlated with lymph node metastasis (P = 0. 028) and lower 5-year survival (P = 0. 018). The survival curves calculated by Kaplan-Meier method further showed that the patients with strong 14-3-3ε expression had a shorter survival than patients with negative or weak 14-3-3ε expression (Log-rank,P =0. 031 ). No correlation was found between subcellular localization of 14-3-3ε in tumor cells and clinicopathologic factors and prognosis of ESCC patients. Conclusion The 14-3-3εexpression is significantly up-regulated in ESCCs. It was usually located in cytoplasm of tumor cells, but nucleus of normal epithelia. Strong expression of 14-3-3ε in tumors is associated with lymph node metastasis and considered as an poor prognostic factor for ESCC.     

人肺腺癌A549细胞系干细胞样细胞的培养检测及其抗顺铂能力的研究

目的:从人肺腺癌A549细胞系中培养获得含干细胞样细胞的球细胞(Sphere细胞),检测相关标志物表达及其对顺铂的耐药性.方法:采用含特定生长因子的无血清培养基诱导A549细胞的Sphere细胞形成,用亲脂荧光染料标记技术和免疫荧光法检测Sphere细胞中干细胞的存在,用流式细胞术检测干性标志物CD133,OCT4,C...     

HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统，并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA，以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体，酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞，以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞，通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组（NEG-shRNA）、干扰组（shRNA-HSP90β）、过表达NC对照组（NEG-pEZ）及过表达组（pEZ-HSP90β）。通过qRT-PCR 与Western blotting 分别从mRNA 和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后，嘌呤霉素最小致死浓度1 μg/ml，感染复数200，感染人Saos-2的感染效率达80%，其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%，pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2.8倍。进一步研究发现，shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低，pEZ-HSP90β组较NEG-pEZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功，并能够在Saos-2中稳定表达。