反转录病毒介导的Luciferase基因稳定转染细胞株的建立及其生物发光成像检测

目的 建立反转录病毒介导的Luciferase基因(Luc2)稳定转染的细胞株,通过体内及体外实验探讨Luc2阳性细胞数与生物发光成像系统光通量之间的关系.方法 采用分子克隆方法构建pMX-Luc2质粒,将其与pMD.G质粒共转染293T gag-pol细胞,获得表达Luc2的反转录病毒.将该反转录病毒感染小鼠结肠癌CT26、人小细胞肺癌NCI-H446、人结肠癌HT-29、人卵巢癌SKOV3、人肝癌sMMC-7721细胞系,建立并筛选Luc2阳性表达的细胞株.分别接种10～1×104个SKOV3-Luc2细胞于培养皿中,在4只裸鼠背侧皮下16个位点分别接种200μl不同浓度(1×107、5×106、2.5×106、1 × 106、5×105、2.5 × 10s、1×105、5 × 104/ml)的SKOV3-Luc2细胞,在另外4只裸鼠尾静脉中分别注射1 ×106和3×106个SKOV3-Luc2细胞.采用生物发光成像系统检测体外、体内接种细胞的光通量值.结果 成功获得表达Luc2的反转录病毒,感染肿瘤细胞系CT26、NCI-H446、HT-29、SKOV3、SMMC-7721,筛选阳性细胞株,均可稳定表达Luc2.体外生物发光成像系统检测结果表明,光通量值与培养皿中接种的细胞数之间存在显著的线性关系(R2=0.944,β=0.972,P＜0.01);活体检测结果表明,光通量值与裸鼠尾静脉注射和皮下接种的细胞数之间均存在显著的线性关系(R2=0.991,β=0.996,P＜0.01; R2=0.351,β=0.628,P＜0.01).结论 采用表达Luc2的反转录病毒感染肿瘤细胞系是快速建立Luc2阳性细胞株的一种可行方法.Luc2阳性细胞数与生物发光成像系统中光通量值具有显著的线性关系.     

In Situ PLA技术原位分析MTA1与NuRD复合体其他组分的相互作用

目的原位检测肿瘤转移相关蛋白MTA1与NuRD复合体其他组分-Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用并分析MTA1/NuRD复合体在HCT116细胞中的分布情况。方法首先利用co-IP技术体外验证MTA1与NuRD复合体其他组分Mi2、HDAC2及MBD3在HCT116细胞裂解液中的相互作用。然后利用In Situ PLA技术,体内原位检测MTA1与三者的相互作用,并根据镜下阳性荧光信号数目,比较MTA1与Mi2、HDAC2及MBD3之间的作用强弱;根据相互作用位点的亚细胞分布情况,分析间期及M期MTA1/NuRD复合体的核质分布情况。结果首次从体内原位水平证实MTA1与NuRD复合体其他组分-Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用;其作用强度HDAC2最高,Mi2次之,MBD3最弱;首次发现MTA1/NuRD复合体存在很明显的胞质分布（约占总量的1/4）;另外,我们还首次发现在M期MTA1/NuRD复合体不再位于核区,而是位于染色体外周。结论In Situ PLA技术是一项有效的原位检测蛋白相互作用的新技术;MTA1/NuRD复合体可能参与MTA1胞质中功能的发挥;并且其胞质分布可能参与M期进程调控。     

钙网蛋白在甲氨蝶呤耐药绒毛膜癌中的作用研究

目的:探讨钙网蛋白(CALR)在对甲氨蝶呤(MTX)耐药的人绒毛膜癌中的作用.方法:采用Western blot印迹和细胞免疫荧光方法检测CALR蛋白在对MTX间断诱导耐药绒毛膜癌细胞株JeG-3/MTXA1与亲本细胞JeG-3中的表达差异,观察利用RNA干扰(RNAi)技术干扰CALR表达后耐药细胞耐药指数的变化.结果:Western blot验证结果,CALR在耐药细胞JeG-3/MTXA1中的表达明显高于亲本细胞JeG-3.细胞免疫荧光结果,在耐药细胞JeG-3/MTXA1中,CALR蛋白表达明显较亲本细胞JeG-3增多,且近核表达增强.经过RNAi后,耐药细胞JeG-3/MTXA1的耐药指数下调74.05％ (33.94±0.68 vs 8.81±1.58),而对细胞增殖无明显影响.结论:CALR蛋白在耐药细胞中明显上调,干扰其表达后耐药细胞可明显降低其耐药指数.CALR可能参与对MTX耐药绒毛膜癌的发生.     

以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法

目的利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系。方法利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列。以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP。将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒。以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系。将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系。结果测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列。免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系。相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P<0.01。结论利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型。该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系。     

食管癌细胞系KYSE150中RNA干扰MTA1的基因芯片分析

目的探讨MTA1对食管癌转移相关基因的影响。方法用RNA干扰的方法在食管癌细胞系KYSE150中沉默MTA1基因的表达,随后进行转移相关基因芯片分析。以两次芯片分析中均上调2倍以上(或下调1/2)为差异显著基因。通过DIVID生物信息学数据库进行gene ontology的通路分析。结果在两次基因芯片分析中均有意义上调的基因共有7个,分别是LAMC1、MMP14、MMP15、MDM2、API5、ODC1、PTGS2;而两次均显著下调的基因共有14个,它们是CSF1R、HGF、IGF2、ITGA6、MMP9、MMP11、MMP13、CASP8、CTSD、TMPRSS4、THBS2、TIMP1、ENPP2、SNCG。通过在DAVID生物信息学数据库中对上述表达差异显著的基因进行通路分析,结果提示差异基因主要富集在5条信号通路上,分别是肿瘤信号通路(MDM2、CASP8、CSF1R、HGF、ITGA6、LAMC1、MMP9、PTGS2)、ECM受体整合信号通路(LAMC1、THBS、ITGA6)、基质金属蛋白酶信号通路(TIMP1、MMP9)、小细胞肺癌信号通路(ITGA6、Cox2)和黏着斑信号通路(ITGA6、HGF、IGF2)。结论 MTA1参与了转移相关的一系列分子改变事件,尚需进一步的分子生物学方法验证这些基因调控的信号途径。     

干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞的生物学特性

目的探讨干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞的相关蛋白表达及生物学特性。方法用干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞,Western blot检测干细胞相关蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期;同时检测干细胞增殖、黏附、耐药及侵袭能力,并摸索结肠癌干细胞最佳冻存条件。结果用干细胞培养基成球培养法成功培养出了结肠癌细胞球,检测发现干细胞相关蛋白表达增强,静止期细胞比例明显升高,细胞增殖速度慢,黏附性、耐药性、侵袭性均强于亲本细胞。结论干细胞培养基成球培养法筛选的细胞球中富集了肿瘤干细胞,为结肠癌干细胞的研究提供了良好的细胞模型。     

结肠癌组织中MTA1的表达水平及定位与患者预后的相关性研究

目的研究结肠癌组织中MTA1的表达水平及在细胞核、细胞质内的定位情况,分析其与结肠癌预后的相关性,并探讨其可能的机制。方法采用免疫组织化学染色方法在结肠癌组织芯片(30例肠癌组织、10例转移组织、8例正常组织)中检测MTA1与Sox2蛋白的表达水平及定位情况,统计分析二者与临床病理资料及预后的相关性;并初步探讨Sox2与MTA1表达的相关性。结果①肠癌组织及转移组织中MTA1细胞质染色强度均显著高于正常组织(P<0.05),而肠癌组织与转移组织间MTA1表达差异不显著(P>0.05);②MTA1在细胞质的表达强度与临床分期呈正相关(P=0.03),生存时间<5年的肠癌患者的肿瘤组织细胞质内MTA1的表达强度显著高于生存时间≥5年的患者组织(P=0.007);③Sox2在肠癌组织细胞核及细胞质内的表达均与MTA1细胞质表达具有显著的相关性(P<0.01)。结论 MTA1细胞质过表达提示结肠癌预后不良,这可能与Sox2的过表达相关。     

活体成像系统检测携荧光素酶增殖缺陷型腺病毒在小鼠体内的表达和分布

目的:研究携带荧光素酶的增殖缺陷型腺病毒(Ad-luciferase,Ad-Luci)经不同途径注射后小鼠体内荧光素酶的表达和分布,为肿瘤的腺病毒载体基因治疗提供参考。方法:建立人胰腺癌PANC-1细胞裸鼠移植瘤模型,Ad-Luci病毒单次或多次瘤体内注射,或者肌内、尾静脉和腹腔注射Ad-Luci病毒至正常小鼠,采用IVIS Lumina活体成像系统观察荧光素酶在小鼠体内的分布和表达,并观察Ad-Luci病毒的毒性作用。结果:单次瘤内注射Ad-Luci荧光素酶在瘤内持续表达15 d,多次瘤内注射后表达时间更长。肌内注射组荧光素酶随时间延长表达减弱,注射后48 h无荧光素酶表达。尾静脉注射组荧光素酶大部分聚集在肝脏,注射后18 d仍有表达。腹腔注射组4 h后可见荧光素酶的表达,但7 d后无表达。Ad-Luci各注射组小鼠均未出现明显的毒性反应。结论:腺病毒携带外源基因经瘤内注射可在瘤内表达较长时间,多次注射可延长表达时间;经尾静脉注射后主要聚集在肝脏,且表达时间较长。