实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.     

肺癌细胞促进单核吞噬细胞MAPK相关通路活化诱导炎性细胞因子表达上调的研究

目的：通过建立人单核吞噬细胞系（THP‐1）和人肺腺癌细胞系（SPC‐A1）共培养体系,检测共培养体系中THP‐1的炎性细胞因子mRNA表达水平和丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPK）的表达情况,初步阐明肺癌微环境对THP‐1中炎性细胞因子表达的影响。方法体外培养SPC‐A1细胞系、THP‐1细胞系,并建立二者共培养体系,设置THP‐1单独培养组为对照组。24h后,收集各组THP‐1细胞,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real‐TimePCR）检测白细胞介素（IL）‐1β、‐6、‐8及肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）的mRNA表达水平;Westernblot检测MAPK通路蛋白c‐Jun氨基末端激酶及其磷酸化形式（JNK／p‐JNK）、丝裂原活化蛋白激酶p38亚单位及其磷酸化形式（p38MAPK／p‐p38MAPK）、细胞外调节蛋白激酶及其磷酸化形式（ERK／p‐ERK）的表达。结果共培养24h后,共培养组THP‐1的IL‐1β、IL‐8mRNA表达水平均明显高于对照组（P＜0．05）,分别为对照组的5．81、4．21倍;Westernblot结果显示共培养组p38MAPK、p‐p38MAPK的表达水平均明显高于对照组（P＜0．05）。结论肺癌细胞可引起肺癌环境中单核吞噬细胞中p38MAPK通路的活化,进而诱导IL‐1β、IL‐8mRNA表达上调,有利于肿瘤炎症微环境的维持和促进肿瘤的进展。     

血清CA19-9、CEA水平与胰腺癌预后的关系

目的：探讨胰腺癌患者术前血清中CA19-9与CEA表达情况对预后的影响。方法：回顾分析医院2012年1月～2013年12月128例胰腺癌患者临床病理资料,应用Kaplan．Meier法、Log—rank检验及Cox回归分析CA19-9和CEA水平与患者生存时间的关系。血清中CA19-9〉39U／mL,CEA〉4．7ng／mL被视为表达增高。结果：128例患者平均年龄为62岁,中位生存期为12．2月,其中CA19—9和CEA的表达水平增高的比例分别为78．1％,37．5％。CA19-9、CEA升高组患者的预后明显差于正常组（CA19-9,P=0．027;CEA,P=0．036）。Cox多因素回归分析显示淋巴结转移、CA19—9〉39U／mL、CEA〉4．7ng／mL是影响胰腺癌患者预后的独立因素。结论：术前CA19-9、CEA水平与胰腺患者生存时间密切相关,能有效评估患者的预后。     

母乳及婴儿尿液人巨细胞病毒DNA检测在婴儿人巨细胞病毒感染中的应用

目的:定量检测疑似人巨细胞病毒(HCMV)感染婴儿尿液及对应母亲乳汁中HCMV DNA,评估两者在诊断HCMV感染中的价值,并比较两者浓度之间的关系。方法:选取51例疑似HCMV感染的婴儿,收集其新鲜尿液及对应的母亲乳汁,分别用荧光定量聚合酶链式反应法(FQ-PCR)检测HCMV DNA。结果:51例疑似HCMV感染婴儿尿液中,有49例检测出HCMV DNA,阳性率为96.0%(49/51)。51份婴儿母亲乳汁中,有37份检测出HCMV DNA阳性,阳性率为72.5%(37/51)。对37例尿液与乳汁HCMV DNA均为阳性的患儿,分别对尿液与乳汁HCMV DNA浓度取对数,将两者进行相关性分析,结果显示两者之间存在一定的相关性,相关系数为0.332(P<0.05)。结论:婴儿尿液中HCMV DNA检测对于婴儿HCMV的感染具有重要的价值,同时对其母乳HCMV DNA检测,可以发现婴儿尿液和母乳HCMV DNA具有一定的相关性。     

体外培养人单个核细胞分泌IFN-γ水平的观察

目的对体外培养的人脐带血和外周血单个核细胞(MNC)以植物血凝素(PHA)刺激,观察培养上清中IFNγ含量变化。方法常规Ficoll离心法分离人MNC,接种24孔培养板,同时加入PHA,体外培养5d,计数不同培养时间的细胞总数;ELISA法测定不同培养时间上清中的IFNγ含量。结果经PHA刺激后,脐血MNC数量约扩增了12倍,单位细胞量所分泌的IFNγ是健康人血浆水平的30倍。而健康人外周血MNC数量约扩增了5倍。单位细胞量所分泌的IFNγ是健康人血浆水平的15倍。结论与人外周血MNC相比,人脐带血MNC对PHA刺激具有良好的反应性,经PHA刺激后可分泌更高水平的IFNγ,表明其在移植物抗白血病(GVL)效应中起一定作用。     

黄芪对急性弓形虫感染小鼠的血清IFN-γ及IL-18的影响

目的研究黄芪对RH株弓形虫100个速殖子感染的小鼠血清IFN-γ及IL-18水平的动态影响,以探讨黄芪对急性弓形虫感染小鼠保护作用的机制。方法建立102速殖子感染小鼠模型,设黄芪治疗组和对照组。两组分别定期处死小鼠取血清。用ELISA测定感染后2、4、6、8d血清IFN-γ水平及感染后4、6、8d的血清IL-18水平。结果感染后黄芪组IFN-γ水平持续上升,4d和8d分别为21.0pg/ml和15.36pg/ml,显著高于对照组(5.62pg/ml和9.73pg/ml)(P<0.05)。感染后黄芪组血清IL-18水平持续上升,8d为594.75pg/ml,显著低于对照组(709.00pg/ml)(P<0.05)。结论黄芪可能通过双向调节宿主的非特异免疫应答对急性弓形虫感染小鼠产生保护作用。     

南京地区社区成年健康人群鼻咽部机会致病菌携带情况调查

目的了解南京地区社区成年健康人群鼻咽部机会致病菌携带情况。方法对南京地区社区1019例成年健康者进行非感染状态下鼻咽拭子菌种鉴定。结果鼻咽部检出率较高的机会致病菌依次为凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌属、肺炎链球菌和肺炎克雷伯杆菌;单一菌群携带率为30.7%,复合致病菌携带率为3.4%,总携带率为34.2%;随年龄增长,金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌属的检出率显著降低(P<0.05)。结论南京地区社区健康成年人群鼻咽部普遍存在大量凝固酶阴性葡萄球菌,同时金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌属、肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌等亦有较高检出率。     

卵巢癌细胞通过P38 MAPK通路促进CD8~+调节T细胞的生成

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在卵巢癌细胞(SKOV3)诱导CD8+Treg分化过程中的作用。方法建立SKOV3与健康人CD8+T细胞体外共培养体系,设置CD8+T细胞单独培养组为对照组。共培养5 d后,收集各组CD8+T细胞,荧光定量PCR和流式细胞术检测CD8+T细胞中Treg相关标志物(CD25、Foxp3、CD28)的表达率;功能抑制试验检测两组CD8+T细胞对nave CD4+T细胞增殖能力的影响;Western blot检测MAPK通路相关蛋白(ERK/p-ERK、JNK/p-JNK、P38 MAPK/p-P38 MAPK)的表达水平;P38 MAPK特异性抑制剂SB203580预处理CD8+T细胞后,评价CD8+T细胞中Treg相关标志物(CD25、Foxp3、CD28)的表达变化。结果共培养组CD8+T细胞中CD25及Foxp3表达率均显著高于对照组(P0.05),CD28表达率显著低于对照组(P0.05);共培养组CD8+T细胞相比对照组,抑制nave CD4+T细胞的增殖力增强;Western blot结果显示,共培养组p-P38 MAPK的表达水平显著高于对照组(P0.05),SB203580预处理后CD8+T细胞中Treg相关标志物表达率均下调。结论卵巢癌细胞通过活化CD8+T细胞的P38 MAPK信号通路诱导具有抑制作用的CD8+Treg的生成,促进肿瘤进展。     

卵巢癌患者外周血CD4+调节T细胞与TGF-β1水平的相关性研究

目的：探讨卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的水平及其与转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）水平的相关性。方法：采用流式细胞术对24例上皮性卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平进行检测,收集每例患者对应的血浆,ELISA法检测卵巢癌患者血浆中TGF-β1浓度,并选20例卵巢良性疾病及20例健康体检者做对比研究。结果：与卵巢良性疾病及健康对照组相比,卵巢癌患者CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞及TGF-β1的表达水平明显增高（均P<0.01）;Ⅲ~Ⅳ期卵巢癌患者CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞及TGF-β1的表达水平明显高于Ⅰ~Ⅱ期患者（P<0.05）;Pearson相关性分析结果显示,卵巢癌患者外周血CD4+CD25+及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平与血浆TGF-β1水平均呈正相关（r=0.656, P<0.05; r=0.574, P<0.05）。结论：卵巢癌患者外周血存在高水平CD4+调节T细胞,且其与血浆TGF-β1水平呈正相关。检测外周血CD4+调节T细胞与TGF-β1水平对于判断卵巢癌不同病期有重要意义。TGF-β1水平增高可能参与调节CD4+调节T细胞对卵巢癌机体的免疫负调节机制。     

头孢哌酮和哌拉西林与β内酰胺酶抑制剂对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的后效应研究

目的测定头孢哌酮和哌拉西林与克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦3种β内酰胺酶抑制剂的不同复方的最低抑菌浓度（MIC）、抗生素后效应（PAE）、β内酰胺酶抑制剂后效应（PLIE）和亚抑菌浓度后效应（PASME）。方法以肉汤稀释法测定MIC；以菌落计数法测定菌落形成单位（CFU），根据CFU做生长曲线，计算PAE、PLIE、PASME。结果不同比例复方对产β内酰胺酶菌株的MIC较单方呈2—256倍的降低。无论单方还是复方均无长PAE。3种β酰胺酶抑制剂的PLIE对于大肠埃希菌有正有负（－2．25h～〉5h），而对于肺炎克雷伯菌均为正值（0．34h～5．37h）。对于肺炎克雷伯菌，0．2MIC的头孢哌酮／舒巴坦（1／1）的PASME为0．32h，0．1MIC、0．2MIC的哌拉西林／克拉维酸（8／1）的PASME分别为2．96h、4．41h。结论同时具有长PLIE及PASME的复方，PLIE、PASME较其半衰期在给药方案的设计中更为重要；PAE、PLIE、PASME作为重要的药效动力学参数，可应用于评价新抗菌药物的药效学和优化给药方案。