K-RAS基因突变的套式PCR检测及其在大肠癌中的应用

目的探讨高敏感性K-RAS基因点突变检测方法在大肠癌临床的应用价值。方法用套式聚合酶链反应结合限制性片段多态性分析(PCR-RFLP)检测大肠癌组织及其癌旁组织K-RAS基因第12密码子点突变。结果癌组织K-RAS基因第12密码子点突变率为12%(4/34),表现为GGT→GAT和GGT→GTT,癌旁组织无K-RAS突变。伴有12密码子突变的大肠癌以隆起型为主,患者年龄较大,均属C和D期。结论大肠癌患者K-RAS基因突变与患者的年龄、肿瘤的大体形态和患者Dukes分期等临床病理参数有关。     

金黄色葡萄球菌DNA提取方法的改良

金黄色葡萄球菌DNA多采用经典的溶菌酶、酚、氯仿提取法,但是获取的DNA量较少.我们参照文献报道[1]的方法加以改良,建立一种DNA制备方法.介绍如下. 1 材料和方法     

非小细胞肺癌组织中抑癌基因APC表达的研究

目的探讨非小细胞肺癌组织中APC基因mRNA转录水平。方法采用RT-PCR技术,以SybrgreenⅠ为荧光染料,beta-actin基因为内参照,对17例临床确诊的非小细胞肺癌病例的正常肺组织和肿瘤组织的APC基因mRNA进行实时荧光定量检测。计算每份标本Ct(APC)/Ct(beta-actin)比值,比较每份病例正常肺组织和肿瘤组织比值之间的差值(d),配对t检验。结果在17例病例中,APCmRNA在肺癌组织中的表达较正常肺组织明显降低(d=-0.29,P<0.05)。结论肺癌患者正常肺组织和肿瘤组织APC基因转录存在明显差异,肺癌组织APC基因转录水平降低。     

抗C3d单抗制备及免疫金层析法的建立

目的 研制抗C3d单抗,建立免疫金层析法检测血浆补体片段C3d,判断补体活化情况。方法 用菊糖—C3d作抗原,免疫Balb/c小鼠,并制备杂交瘤,以羊抗C3包被酶标反应板并结合C3d为检测板,筛选分泌抗C3d单抗的杂交瘸。利用protein G柱亲和层析提取抗C3d单抗IgG和C3d结合物,进行SDS-PAGE电泳,鉴定单抗的特异性。将抗C3d单抗标以胶体金,制备免疫金层析测试余。通过在免疫金中加未标金的抗C3d单抗(游离单抗)来调整试纸条的灵敏度,并测定C3d。结果 SDS-PAGE电泳图上,出现IgG的重链、轻链、及C3d 3个条带;金标记抗C3d单抗的试条(Ⅰ)测C3d的灵敏度在6—10ng/m1,当加入0．1μg/m1游离抗C3d单抗(Ⅱ)后,灵敏度为10—15ng/m1。利用两种试条灵敏度的不同,对轻、中重型肝炎检测,结果轻型肝炎患者在纸条Ⅰ上阳性率为83．3％(25/30),纸条Ⅱ全为阴性,中重型肝炎者在纸条Ⅰ、Ⅱ的阳性率为100％(30/30)。结论 用本试验建立的免疫金层析法测定肝炎患者血浆C3d水平,可判断补体活化程度,辅助乙型肝炎轻、重分型。     

小儿急性淋巴细胞白血病微量残留病T细胞受体δ基因重排的PCR检测

白血病是造血系统的恶性肿瘤,其中急性淋巴细胞白血病(ＡＬＬ)是儿童最常见的白血病。患儿经初治后,体内仍有少量的残留白血病细胞(108-1010)称微量残留病(ｍｉｎｉｍａｌｒｅｓｉｄｕａｌｄｉｓｅａｓｅ,ＭＲＤ)。这是白血病复发的主要根源,大多数出现于复发期的肿瘤细胞,且与初诊时的肿瘤细胞来源同一克隆。目前普遍认为提高白血病治愈率的关键之一是要彻底地根除ＭＲＤ,但ＭＲＤ用一般形态学检测很难发现。应用聚合酶链反应(ＰＣＲ)技术检测急性淋巴细胞性白血病Ｔ细胞受体(ＴＣＲ)克隆性基因重排的研究已有不少报道[1,2]。ＴＣＲ由四条…     

胰岛素样生长因子Ⅰ对A549细胞和淋巴细胞IGF-Ⅰ受体mRNA表达调控的研究

目的研究肺腺癌细胞株A549和淋巴细胞在外源性胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)作用下,各自IGF-Ⅰ受体(IGF-ⅠR) mRNA的表达情况.方法采用多重RT-PCR对IGF-ⅠR mRNA进行半定量检测,研究0、5、20、 80、 160、320 ng/ml不同浓度的重组人胰岛素样生长因子Ⅰ(rIGF-Ⅰ)及在某一特定浓度下作用不同时间对培养的A549细胞和淋巴细胞IGF-ⅠR mRNA表达的影响.结果当IGF-Ⅰ增加至20 ng/ml以上,淋巴细胞IGF-ⅠR mRNA的表达显著降低,而A549细胞IGF-ⅠR mRNA的表达未见明显改变.结论外源性IGF-Ⅰ不能显著降低肺腺癌细胞IGF-ⅠR的转录水平,提示IGF-ⅠR在肺腺癌的恶性增殖过程中可能起重要作用.     

抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的制备及鉴定

摘要：目的：制备抗人非小细胞肺癌（NSCLC）的单克隆抗体(McAb),并对其生物学特性及特异性进行鉴定。 方法：以人肺腺癌细胞株SPC-A1为抗原,免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合,间接细胞ELISA法筛选阳性细胞克隆;多种细胞间接ELISA及间接免疫荧光法鉴定其特异性;western blot分析其特异性结合抗原的相对分子量;免疫组化染色分析单抗的组织特异性。 结果：得到1株高效价的、稳定分泌IgG1抗人NSCLC单抗的细胞株（NJ488-1）,纯化后效价为2×10⁶;间接细胞ELISA 及间接免疫荧光法证实NJ488-1能特异地识别肺癌细胞系,其识别抗原定位于SPC-A1细胞胞浆区;western blot显示NJ488-1特异性结合的抗原相对分子量(Mr)为70 000左右;免疫组化结果表明NJ488-1与NSCLC组织有强阳性反应。 结论:成功地制备并鉴定了抗人NSCLC单抗NJ488-1,为肺癌的进一步研究及NJ488-1的临床应用奠定了基础。     

miR-145在非小细胞肺癌中的表达及其对N-cadherin表达的调控

目的:检测miR-145在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达,并探讨其调控神经性钙黏附蛋白(neural cadherin,N-cadherin)在NSCLC侵袭转移中的作用?方法:实时荧光定量PCR检测31例NSCLC组织中miR-145与N-cadherin的表达水平?采用脂质体法将miR-145 mimics瞬时转染至SPC-A1细胞,RT-PCR和Western blot检测N-cadherin的表达变化;Transwell实验检测转染后SPC-A1细胞的侵袭能力?结果:在NSCLC癌组织中,miR-145与N-cadherin的表达水平分别表现为显著下调和上调,且表达水平与淋巴结转移密切相关?在SPC-A1细胞中,过表达miR-145能降低N-cadherin的表达,并抑制肿瘤细胞的侵袭?结论:miR-145在NSCLC中低表达,其可能通过靶向调控N-cadherin而影响NSCLC的侵袭转移?     

Toll样受体在卵巢癌发生发展中作用机制的初步探讨

目的:观察卵巢癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs) mRNA的表达水平,研究高表达TLRs在卵巢癌发病中的可能机制?方法:研究对象包括卵巢癌24例?妇科良性疾病22例及同期健康体检女性22例?采用密度梯度离心法分离PBMC后,提取总RNA,并逆转录为cDNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法检测TLR1~TLR9 mRNA的表达水平;选择mRNA高表达的TLRs的相应激动剂刺激PBMC,采用Real-time PCR检测PBMC中前炎症细胞因子白细胞介素(IL)-1β?IL-6?IL-12P40的mRNA表达水平?结果:各组PBMC中TLR1~TLR9均有表达;卵巢癌组PBMC 中TLR2?TLR6表达量显著高于健康对照组(TLR2:F = 3.27,P < 0.05;TLR6:F = 2.21,P < 0.05);卵巢癌组TLR2的表达量明显高于妇科良性疾病组(F = 3.24,P < 0.05);良性疾病组TLRs表达水平与健康对照组间无显著性差异;各组PBMC经TLR2的激动剂HKLM刺激24 h后,卵巢癌组IL-1β?IL-6?IL-12P40 mRNA表达明显增强,分别为健康对照组的2.24?2.94?2.35倍(P < 0.05),为良性疾病组的2.02?2.50?2.85倍 (P < 0.05);良性疾病组与健康对照组比较无显著改变(F = 1.11,F = 1.18,F = 0.82,P > 0.05)?结论:卵巢癌患者PBMC中TLR2?TLR6表达水平显著增高,经其介导的炎症因子IL-1β?IL-6?IL-12P40 mRNA表达水平的改变可能在卵巢癌的发生发展中发挥作用?     

卵巢癌外周血CD4+调节T细胞与TGF-β1水平的相关性研究

目的 探讨卵巢癌患者外周血中CD4₊CD25₊及CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞的表达,及其与转化生长因子β1(TGF-β1)水平的相关性。方法 采用流式细胞术检测24例上皮性卵巢癌患者外周血中CD4₊CD25₊及CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞的表达,收集每例患者对应的血浆,ELISA法检测卵巢癌患者血浆中TGF-β1浓度,并与20例卵巢良性肿瘤及20例健康体检者做比较研究。结果 与卵巢良性疾病及健康对照组相比,卵巢癌患者CD4₊CD25₊、CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞及TGF-β1的表达水平明显增高(均P<0.01);III/IV期卵巢癌患者CD4₊CD25₊、CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞及TGF-β1的表达水平明显高于I/II期患者(P<0.05);Pearson相关性分析结果显示,卵巢癌患者外周血CD4₊CD25₊及CD4₊CD25₊Foxp3₊调节性T细胞水平与血浆TGF-β1水平均呈现正相关关系(r=0.656, P < 0.05; r=0. 574, P < 0.05)。结论 卵巢癌患者外周血高表达CD4₊调节T细胞,且与血浆TGF-β1呈正相关。检测外周血CD4₊调节T细胞与TGF-β1水平对于判断卵巢癌病期有重要意义。TGF-β1水平增高可能参与调节CD4₊调节T细胞对卵巢癌机体的免疫负调节机制。