大鼠IL-10真核表达载体在软骨细胞中的表达

目的 构建大鼠IL-10真核表达载体并在大鼠软骨细胞中进行表达。方法 将目的基因片段通过酶切连入真核表达载体pcDNA3，并以Super Fect Transfection Reagent介导转入大鼠软骨细胞表达，RT-PCR检测细胞中mRNA水平，及ELISA检测细胞培养上清液中的IL-10蛋白含量。结果 成功构建了大鼠IL-10真核表达载体，转入软骨细胞后，检测到细胞内IL-10 mRNA转录，细胞培养24、48和72h后，经ELISA检测上清液中IL-10蛋白含量分别为36、62和100pg/mL。结论 大鼠IL-10真核表达载体的构建并在软骨细胞中表达，为研究IL-10诱导软骨细胞同种异体移植耐受奠定了基础。     

柚皮苷对犬骨髓基质细胞体外增殖及成骨分化的影响

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)在柚皮苷诱导下定向成骨及成骨分化能力。方法:抽取犬骨髓,贴壁法体外培养,流式细胞仪鉴定,加入不同浓度柚皮苷(1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L)诱导,以CCK-8检测药物毒性,定量检测碱性磷酸酶、von Kossa检测钙结节形成。采用SPSS20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:经流式细胞仪检测,CD34、CD45低表达、CD90高表达分别为0.126%、0.075%和95.4%;柚皮苷浓度在10-6、10-7 mol/L时,能明显促进细胞增殖;经柚皮苷诱导后,碱性磷酸酶含量显著提高,其中,浓度为10-6 mol/L时,ALP相对值最高(P<0.05);von Kossa钙结节检测呈阳性。结论:犬骨髓基质细胞在柚皮苷诱导下能分化为成骨细胞。柚皮苷浓度为10-6 mol/L时,能明显促进骨髓基质细胞的增殖及分化。     

肝癌干细胞标志物及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌干细胞生长的影响

目的:研究肝癌细胞系SMMC7721肿瘤干细胞表面标志物,探讨细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌细胞的生长抑制作用,以及其对肝癌细胞中具有干细胞特性群体的影响。方法:用流式细胞仪将肝癌细胞按细胞表面标志CD133、CD44进行分离,分为CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4个群体,采用脂质体法将细小病毒H-1非结构蛋白NS-1质粒转染入人肝癌细胞SMMC7721,采用G418筛选稳定转染的细胞克隆,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞NS-1基因的表达。流式细胞仪分析SMMC7721转染前后肿瘤干细胞表面标志CD133、CD90、CD44的表达和细胞生长周期,检测细胞群体的变化。以裸鼠成瘤实验和软琼脂克隆形成实验评价具肿瘤干细胞性质的肝癌细胞表面标志物以及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1转染对肝癌细胞生长的影响。结果:肝癌SMMC7721细胞分成CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4组亚群的细胞存在着异质性,4组亚群细胞中均有少数肿瘤干细胞样细胞能在软琼脂上形成克隆,其中CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群克隆形成率分别为3.5%和1.8%,CD133-CD44+、CD133-CD44-亚群克隆形成率为0.7%和0.5%。转染细小病毒H-1非结构蛋白NS-1后,4组亚群细胞克隆的形成率都显著下降。裸鼠成瘤实验提示,CD133+表型的细胞成瘤能力强于CD133-表型细胞,CD133-CD44+亚群细胞成瘤能力最弱。流式细胞仪分析显示转染NS-1后,CD133+群体细胞被明显抑制,由31.9%下降至6.3%,而CD90+和CD44+的表达未出现改变;转染NS-1后细胞S期百分率明显下降。结论:肝癌细胞表型为CD133+CD44+和CD133+CD44-亚群中富含肝癌干细胞,转染细小病毒H-1非结构蛋白基因NS-1的部分亚群SMMC7721细胞生长被抑制,提示其对肝癌细胞株中具有干细胞特性的CD133+群体有一定的抑制效应。     

一种简单快速的γδT细胞扩增方法

建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法。用 5～ 10ml外周血通过CD3细胞的富集、γδ单抗的诱导以及肿瘤细胞刺激的培养体系进行γδT细胞的体外扩增。结果显示 ,γδT细胞能在短时间内快速大量扩增到 10 9～ 10 10 的数量级 ;诱导 4周的CD8、γδ阳性的细胞百分率分别为 42 6 9%和 5 8 6 7% ,明显高于诱导前的 2 3 97%和 6 6 2 % ;γδT细胞对NK敏感的K5 6 2细胞和NK抵抗的Daudi细胞均有较高的杀伤活性 ;γδT细胞对经抗HSP单抗封闭后的Daudi细胞的杀伤率明显下降。该培养体系是一种用血量少、特异、经济、快速的人外周血γδT细胞体外扩增方法。     

MHC Ⅱ类反式激活蛋白调控肿瘤细胞HLA分子的表达

为研究肿瘤细胞ＭＨＣⅡ类分子表达及对ＩＦＮ－γ诱导ＨＬＡ分子表达的反应性与ＣＩＩＴＡ表达的关系。本文采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫组化和流式细胞术检测肿瘤细胞ＨＬＡ分子表达,以ＲＴ－ＰＣＲ检测肿瘤细胞ＣＩＩＴＡ基因肿瘤细胞ＨＬＡⅡ类分子表达与ＣＩＩＴＡ表达一致;组成性或诱导性表达ＣＩＩＴＡ的肿瘤细胞,经ＩＦＮ－γ作用后其ＨＬＡⅠ、Ⅱ类分子表达增高;ＩＦＮ－γ诱导后仍不表达ＣＩＩＴＡ的肿瘤细胞,     

肿瘤的免疫监视和免疫编辑

免疫系统和肿瘤的相互作用中,免疫系统发挥了双重作用。机体的免疫监视作用能抑制非病毒源性肿瘤的发展,同时部分肿瘤在发展过程中经历了免疫系统的重塑,其免疫表型发生改变从而利于其进展。因此,把机体的免疫监视理论作用完善为“免疫编辑”。本篇将对肿瘤免疫编辑的三个过程:清除、平衡和逃逸进行概述,藉此为肿瘤的攻克提供有效的免疫治疗策略。     

转染MHCⅡ类基因对卵巢癌细胞株免疫特性的影响

建立稳定表达CIITA基因的人卵巢癌细胞株HO-CIITA，分析转染CIITA基因对T细胞体外抗肿瘤免疫应答的影响。以CIITA基因逆转录病毒(pLXSN/CIITA)转染并筛选获得HO-CIITA。用FACS和RT-PCR分析HLA以及抗原加工递呈基因表达水平。以磁珠法分离得到正常人外周血CD4 ／CD8 T细胞，分别进行混合淋巴细胞反应及细胞因子测定(ELISA和RT-PCR)。结果显示，转染CIITA基因后，使HO细胞HLA Ⅱ类分子和LMP7基因表达增高，而Ⅱ基因表达由阳性转为阴性，未检测到TAP1表达；HO和HO-CIITA细胞刺激CD4 T细胞分泌IL-4含量两者有显著差异。刺激48h后达到顶峰，前者分泌量约为后者的1／2，但分泌IFN-γ无差异，RT-PCR与ELISA两种测定结果一致。表明转染CIITA基因可增加肿瘤细胞表面MHC Ⅱ类分子的表达，该作用与IFN-γ具有协同效应；并能诱导CD4 T细胞表达IL-4。     

卵巢癌基因治疗的研究现状及进展

随着分子生物学、免疫学以及相关学科的发展，基因治疗可望成为治疗恶性肿瘤的重要方法．目前基因治疗应用于卵巢癌的临床前实验研究已取得较大进展，给卵巢癌特别是晚期患者的治疗带来新的希望。卵巢癌基因治疗的方法主要有基因增补法、基因矫正法、抗血管形成基因治疗、RNA干扰基因治疗等。现综述近几年卵巢癌基因治疗的研究进展。     

猪软骨细胞同种异体移植的免疫排斥机制

目的探讨猪软骨细胞同种异体移植的免疫排斥机制.方法分离制备猪软骨细胞和淋巴细胞,采用同种异体软骨细胞-淋巴细胞混合培养反应和IFN-γ诱导比较分析,经3H-TdR法观察淋巴细胞刺激指数,FACS测定软骨细胞表面猪白细胞抗原(SLA)分子表达变化;不同时间收集混合反应中淋巴细胞,分别应用PCR和ELISA技术分析其表达的IFN-γ、IL-4 mRNA和蛋白含量.结果成功制备了猪的软骨细胞和淋巴细胞,软骨细胞表达SLA I类分子,而不表达SLA II类分子;同种异体软骨细胞对淋巴细胞有轻微刺激扩增作用,经IFN-γ诱导具有明显增强作用.混合培养,18 h后上清中可检测到IFN-γ蛋白,而IL-4表达无变化.结论软骨细胞SLA I类分子刺激同种异体淋巴细胞产生IFN-γ,进一步诱导软骨细胞SLA II类分子表达,从而增强淋巴细胞对软骨细胞的免疫排斥反应.