基于胃癌MG7-Ag模拟表位基因疫苗的构建

目的 构建以胃癌MG7－Ag模拟表位为基础的DNA疫苗。方法 将HindⅢ酶切位点、ＭＧ７－Ａg模拟表位和通用性辅助性Ｔ细胞（Ｔh细胞）表位编码序列的反向互补序列顺次设计于下游引物中，通过２次聚合酶链式反应将２种表位连接于一段载体基因，ＨindⅢ酶切位点位于载体片段与表位基因之间，将目的基因插入pUCm-T载体，酶切鉴定和序列测定证实后，利用pUCm-T载体和pcDNA3.1( )载体共有的ＫpnⅠ和ＸbaⅠ酶切位点，将目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )载体，酶切鉴定后，利用目的的基因和pcDNA3.1（＋）载体上的ＨindⅢ酶切位点，ＨindⅢ酶切去除载体基因片段，得到胃癌ＭＧ７－Ａg模拟表位和通用性Ｔh细胞表位的真核表达载体。结果 经序列测定证实：ＰＣＲ产物为载体基因、ＨindⅢ酶切位点、ＭＧ７－Ａg模拟表位及通用性Ｔh细胞表位的融合片段，最终得到的重组pcDNA3.1（＋）质粒含有正确编码以上２种表位的基因片段。结论 以胃癌ＭＧ７－Ａg模拟表位为基础的ＤＮＡ疫苗构建成功，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。     

难治性克罗恩病的治疗进展

本文简介了难治性克罗恩病的概念和各种药物的治疗进展,以及干细胞移植术的临床应用等,对难治性克罗恩病的治疗具有指导意义。     

表达胃癌MG7-Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗的研制和初步鉴定

目的 研制可表达胃癌MG7－Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗。方法 将NcoI位点和MG7－Ag模拟表位编码序列的互补序列设计到上游引物的5′端。以含有HBcAg全序列的质粒p1.2Ⅱ为模板，通过PCR扩增，获得MG7－Ag模拟表位与HBcAg的融合基因。将目的基因插入载体pUCm-T，经酶切鉴定和序列测定证实后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌X4550互补的质粒pYA3341中，再以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌X4550。结果 序列测定证实，PCR产物为胃癌MG7－Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片段；最终得到含有目的基因片段的重组表达载体pYA3341。重组质粒在X4550中的表达产物，经Western blot表明，在相对分子质量（Mr)约在22000处有1条可与抗MG7 mAb特异性结合的多肽表位。结论 成功地研制可表达胃癌MG7－Ag模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。     

环氧合酶-28473 T/C位点基因多态性与中国汉族人群溃疡性结肠炎易感性的相关性研究

背景：溃疡性结肠炎（UC）是由环境、感染、免疫、遗传等多因素相互作用所致的肠道慢性炎症,其中遗传易感性可能在UC的发病中起重要作用。目的：了解中国汉族UC患者环氧合酶（COX）-23’非翻译区8473T/C位点基因多态性及其与UC发病的可能相关性。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对291例UC患者和286名健康对照者的COX-23’非翻译区8473T/C位点的单核苷酸多态性进行检测。结果：与健康对照组比较,UC组COX-28473T/C位点TT基因型频率较低（58.8%对64.3%）,而TC、CC基因型频率较高（36.8%对33.9%、4.5%对1.7%）,但差异均无统计学意义（P〉0.05）。两组受检者T等位基因频率均较高,两组间C等位基因频率差异无统计学意义（P=0.092）。结论：COX-23’非翻译区8473T/C位点基因多态性与中国汉族UC患者的遗传易感性无相关性。     

Id1真核表达载体的构建及胃黏膜上皮细胞系的转染

目的: 扩增Id1基因,构建Id1真核表达载体pcDNA3.1/V5HisA-Id1. 方法: 以胃癌细胞SGC7901cDNA为模板,以Id1基因编码区外的两段特异性序列为引物,获得Id1基因的全长. 将目的基因插入载体pUCm-T,经序列测定证实后,亚克隆至pcDNA3.1/V5HisA并经酶切鉴定. 采用脂质体转染的方法将重组质粒稳定转染至胃粘膜上皮永生化细胞系GES-1中. 结果: 经RT-PCR方法扩增出大小为608 bp的基因片断,序列测定其编码序列及读框正确. 亚克隆经酶切鉴定正确. 经过8 wk G418筛选后,获得稳定表达Id1的细胞亚系. 经Western blotting 证实,Id1蛋白表达水平高于对照组. 结论: 成功地构建了Id1真核表达载体,为进一步研究其在胃癌细胞中的作用奠定了基础.     

电压门控钾通道Kv1.5反义核酸对胃癌细胞SGC7901生长的抑制作用

目的构建电压门控钾通道Kv1．5分子的反义核酸(Kv1．5AS)的真核表达载体,建立Kv1．5AS转染的胃癌SGC7901细胞亚系,探讨Kv1．5分子对胃癌细胞生长的抑制作用。方法通过DNA重组技术,将Kv1．5全长eDNA片段从pBKKvl．5载体反向亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1,构建表达Kv1．5反义核酸的重组载体pcDNA3．1-Kv1．5AS。借助脂质体将pcDNA3．1-Kv1．5AS转导入胃癌细胞SGC7901。通过MTT实验绘制细胞生长曲线,肿瘤细胞集落形成实验检测集落形成率,流式细胞仪进行细胞周期分析,并利用Western blot检测Kv1．5和CyclinD1蛋白在基因转染细胞中的表达。结果限制性酶切鉴定结果提示,重组载体peDNA3．1-Kvl．5AS构建成功。Western blot结果表明,转染pcDNA3．1-Kv1．5AS后,Kv1．5蛋白在SGC7901细胞中的表达显著降低。与转染空载体的对照细胞相比,转染Kv1．5AS表达载体后,SGC7901细胞生长变缓,集落形成率显著降低,细胞发生了G1期阻滞。Western blot结果证实,CydinD1蛋白在Kv1．5AS转染细胞中表达降低。结论电压门控钾通道Kv1．5反义核酸可抑制胃癌细胞SGC7901的生长。