龟板提取物诱导神经干细胞向神经元分化过程中相关microRNA表达变化

【目的】观察龟板提取物诱导神经干细胞（neural stem cells, NSCs）向神经元细胞定向分化过程中相关microRNA表达的变化。【方法】分离培养孕14 d SD胎鼠原代神经干细胞,经免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特异抗原及其多向分化能力。神经干细胞随机设空白对照组、龟板提取物低浓度组（3μg/mL）、龟板提取物高浓度组（30μg/mL）。诱导分化7 d,提取各组细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测不同组别miR-124和miR-9的变化。【结果】与空白对照组比较,龟板提取物低浓度组miR-124和miR-9表达均无显著变化,龟板提取物高浓度组均显著升高（P<0．05）。【结论】龟板提取物可能通过调控miR-124、 miR-9表达在NSCs向神经元细胞定向分化过程中起重要作用。     

龟板含药血清对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的：观察益肾龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）体外增殖过程的增殖细胞核抗原（Proliferation cell nuclear antigen,PCNA）表达的影响。方法：使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经Brdu标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC增殖过程。用免疫组织化学方法和原位杂交方法检测MSC的PCNA及其mRNA表达;免疫荧光细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测PCNA蛋白表达的变化。结果：龟板血清以浓度依赖方式促进MSC的PC-NA及其mRNA表达阳性细胞数和PCNA蛋白表达,与对照组比较有显著性（P〈0.05）。结论：龟板血清促MSC增殖作用可能与上调PCNA表达有关。     

基于激光解析/离子化飞行时间质谱技术的中药龟甲胶蛋白质组分析

目的对传统中药龟甲胶蛋白质、肽成分进行组蛋白质组分析。方法采用饱和硫酸胺沉淀,透析脱盐法获得龟甲胶蛋白质成分,美国Ciphergen Biosystems Inc.ProteinChip Biology System(PBSⅡ )及配套的NP10芯片、激光解析/离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF MS,Surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flightmass spectro metry)技术,分析了龟甲胶1 500～13 000 Da区间蛋白质、肽分布及其分子量。结果龟甲胶蛋白质/肽质量1 500～3 000区间显示1个分子量峰;4 800～5 400显示3个分子量峰,其中相对分子量分别相差410.8、151.7;8 000～8 600区间显示1个分子量峰;10 000～13 000区间显示1个分子量峰。共获得6个肽分子量峰。结论通过分析,可以形成龟甲胶蛋白质/肽成分质量指纹图,可作为龟甲胶数字化质控标准;并为进一步分离、纯化及验证龟甲胶功能相关活性蛋白质/肽成分打下基础。     

Extracts from plastrum testudinis reverse glucocorticoid-induced spinal osteoporosis of rats via targeting osteoblastic and osteoclastic markers

Extracts from plastrum testudinis (PTE), an important traditional Chinese medicine, have been demonstrated promotion of osteoblastic function in vitro. This study aims to investigate the protective effect of PTE on glucocorticoid-induced osteoporosis(GIOP) in vivo and analyze therapeutic targets of PTE on GIOP. SD rats were randomly assigned to two experiments: preventive and therapeutic experiments, in which rats respectively received oral PTE at the same time of glucocorticoid injection or after glucocorticoid injection inducing osteoporosis. BMD, microarchitecture, biomechanics, bone metabolism markers and histomorphology were evaluated. mRNA and protein expression of OPG, Runx2, CTSK and MMP9 were examined.Results showed bone quality and bone quantity were significantly elevated by PTE. Histomorphometry showed thicker and denser bone trabecularsand more osteoblasts and less osteoclasts in group of PTE intervention. The mRNA expression of OPG was significantly upregulated whereas expression of CTSK was significantly downregulatedin different groups of PTE intervention. Stronger immunostaining for Runx2 and weaker immunostaining for CTSK were observed in groups of PTE intervention. This demonstrated that PTE may reverse GIOP in prevention and management via targeting OPG, Runx2 and CTSK in mRNA and protein levels.     

龟板提取物上调维生素D受体表达促骨髓间充质干细胞向成骨分化

目的 探讨龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 向成骨分化和对维生素D受体 (VDR) 表达的影响。方法 从大鼠骨髓中分离 MSCs,体外培养,利用流式细胞术检测 MSCs 表面抗原 CD44 细胞标志,体外培养 MSCs 分成不同的组观察其向成骨分化,在培养基中不加任何处理的作为对照组,培养基中加成骨诱导液诱导 MSCs 向成骨分化作为阳性对照组,龟板提取物组在培养基中加龟板提取物,诱导 7 d 后,通过免疫化学染色、Western blotting、原位杂交、RT-PCR 等方法观察龟板提取物对原代培养的 MSCs 向成骨分化的成骨分化标记分子碱性磷酸酶 (ALP)、骨桥蛋白 (OPN) 及 VDR 阳性表达及 VDR mRNA 的表达情况。结果 免疫组化染色显示,龟板提取物组成骨分化标记分子 ALP、OPN 和VDR 的阳性百分比明显高于对照组,Western blotting 结果也显示龟板提取物组的 ALP、OPN和 VDR 的蛋白表达水平高于对照组;同时原位杂交、RT-PCR 结果表明,龟板提取物诱导MSCs 向成骨分化过程可明显促进 VDR mRNA 的表达。结论 龟板提取物可促 MSCs 向成骨分化,其机制可能与 VDR 的上调有关。     

龟板有效成分抗紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞的凋亡

目的确定紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞凋亡模型,筛选抗凋亡的龟板有效成分,为进一步应用开发打下基础。方法分离培养胎鼠表皮干细胞,用流式细胞仪检测CK19和Integrin β1双标阳性细胞鉴定纯度。用紫外线直接照射细胞造成损伤模型,用龟板各成分对照培养,用流式细胞仪检测FITC-Annexin V和碘化丙锭(PI)双标,根据细胞凋亡率确定紫外线损伤模型和筛选具有抗凋亡作用的龟板有效成分。结果①第3代胎鼠表皮干细胞已达到96.57%以上纯度;②紫外线照射量为100mJ/cm2损伤15min再培养20h可获得稳定的损伤模型,总凋亡率为41.06%;③龟板有效成分2B、S6、S8、S9均有抗凋亡作用。结论龟板有效成分S8具有较好的抗紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞凋亡作用,应进一步探讨其机制。     

超细粉碎对龟甲水溶性蛋白质溶出度及煎出率的影响

目的考察超细粉碎对龟板水溶性蛋白质溶出度及煎出率的影响.方法采用传统粉碎方法(通过100目筛,细粉)及超细粉碎方法(通过300目筛,超细粉)比较龟板水溶性蛋白质溶出度,并用正交试验设计研究影响龟板煎出率的工艺条件.结果细粉水溶性蛋白质几乎不溶出,而超细粉20 min溶出度达51.2%,2 h达70.5%.正交试验考察了细度、煎煮次数、煎煮时间3个影响因素,方差分析结果表明细度显著影响煎出率(P＜0.05),而后两者影响不显著(P＞0.05).结论超细粉碎有利于提高龟板水溶性蛋白质的溶出度及煎出率.     

龟板含药血清对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的:观察益肾龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖过程的增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)表达的影响。方法:使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经Brdu标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC增殖过程。用免疫组织化学方法和原位杂交方法检测MSC的PCNA及其mRNA表达;免疫荧光细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测PCNA蛋白表达的变化。结果:龟板血清以浓度依赖方式促进MSC的PC-NA及其mRNA表达阳性细胞数和PCNA蛋白表达,与对照组比较有显著性(P<0.05)。结论:龟板血清促MSC增殖作用可能与上调PCNA表达有关。     

龟板促进Parkinson病大鼠黑质骨形态发生蛋白信号分子的表达

为了进一步探讨骨形态发生蛋白(BMP)/分化抑制因子(Id)通路在龟板抗PD大鼠多巴胺能神经元凋亡中的作用,本实验用6-羟基多巴胺(6-OHDA,0.2%)于大鼠左侧黑质致密带注射2μl造成PD模型,设立正常对照组、模型组和龟板组,用免疫组织化学染色方法观察PD大鼠中脑黑质骨形态发生蛋白IB受体(BMPR-IB),Smad8和Id1阳性细胞数目;用Western-blotting检测BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ、Smad1、Smad5、Smad8和Id1蛋白表达水平的变化。免疫组化染色显示龟板组PD大鼠中脑黑质BMPR-IB,Smad8和Id1的阳性细胞数明显多于模型组(P<0.05)。Western-blotting结果显示龟板组PD大鼠中脑黑质BM-PR-IB,Smad8和Id1的蛋白表达水平高于模型组,而BMPR-IA,BMPR-Ⅱ,Smad1和Smad5没有被检测出。以上结果表明龟板能上调6-OHDA诱导的PD大鼠中脑黑质BMPR-IB,Smad8和Id1的表达,这可能是其抗PD大鼠多巴胺能神经元凋亡的分子机制。     

中药龟板活性部位GC-MS生物活性指纹图谱和应用

目的 探求调控骨髓间质干细胞中药的共性。方法 硅胶柱层析龟板活性部位浸膏，用石油醚-乙酸乙酯作洗脱剂，梯度洗脱，得到16个样品；采用MTT法研究了它们对rMSCs的增殖调控作用，根据总离子图的相似保留时间和相应峰面积，获得促进rMSCs的增殖的指纹图；同样根据它们的总离子图的相似保留时间和相应峰面积也获得了抑制rMSCs增殖的指纹图；用中药龟板提取物有效部位指纹图谱预测中药汤剂“四物汤”和“栽培红厚壳果仁”共7个样品。结果 活性实验结果显示Ts-2、Ts-3、Ts-11、Ts-12、Ts-16能促进rMSCs的增殖作用（P〈0．05）；Ts-4对rMSCs具有明显抑制作用，其他样品对rMSCs的增殖作用不显著（P〉0．05），不具统计学意义；龟板活性部位指纹图谱预测其他中药活性正确率为86％。结论 这种以生物活性为基础的指纹图谱具有科学性，为寻找相似活性的中药提供新思路。