壳聚糖-明胶-碱性成纤维细胞生长因子 三维大孔支架对骨髓间充质干细胞 增殖的影响**☆

背景：干细胞的分化潜能与培养条件有密切关系，改变支架材料的表面特性，三维结构，增加生长因子均可实现对干细胞增殖分化的控制。 目的：制备适合骨髓间充质干细胞附着生长的、具有最佳孔隙率和孔隙结构的药物缓释组织工程支架——三维大孔支架，提供能促进多能干细胞生长的微环境。 设计：重复测量设计。 单位：广州中医药大学基础医学院解剖教研室。 材料：实验所用健康成年SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供。壳聚糖、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司。 方法：实验于2003-03/2006-12主要在广州中医药大学基础医学院解剖教研室完成。采用冷冻干燥的方法，用不同比例的壳聚糖-碱性成纤维细胞生长因子-明胶依次混匀，通过控制冷冻、复温和干燥时间处理使其具有最佳孔隙率和孔结构，制备具缓释碱性成纤维细胞生长因子功能的三维大孔支架。取SD大鼠股骨和胫骨骨髓，分离、培养骨髓间充质干细胞并移植于缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架上进行三维培养，与无碱性成纤维细胞生长因子的支架对照。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 主要观察指标：用ELISA和扫描电镜观察支架的三维结构和缓释性能，用苏木精-伊红染色、MTT、细胞计数及扫描电镜方法观察缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架对骨髓间充质干细胞生长状态和细胞活力的影响。 结果：含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架有碱性成纤维细胞生长因子缓释性能，孔隙尺寸与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架三维结构相比，差异无显著性意义（P > 0.05）。含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能提高在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活率，促进骨髓间充质干细胞黏附、增殖和活力，与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架相比，差异有显著性意义（P < 0.05）。 结论：含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能缓释碱性成纤维细胞生长因子，有利于在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活，为其在组织工程中的应用打下基础。     

小鼠高迁移率族蛋白B1启动子的构建与转录活性检测

【目的】构建小鼠高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子全长序列的荧光素酶报告基因用于药物筛选。【方法】采用PCR技术扩增小鼠HMGB1基因启动子全长序列,用GV238载体构建报告质粒GV238-HMGB1-P-Luc,以pGL3-basic作为阴性对照质粒,与内参质粒pRL共转染Hela细胞,以内毒素(LPS,0.2μg/mL)作为激活剂,以正丁酸钠(SB,10 mmol/L)作为抑制剂,分组处理24 h后检测荧光素酶活性。【结果】经酶切、PCR及测序鉴定证实克隆的HMGB1基因启动子全长2 140 bp,DNA序列正确无突变。与pGL3-basic组比较,GV238-HMGB1-P-Luc组荧光素酶活性显著增强(P0.05);与GV238-HMGB1-P-Luc组比较,LPS组荧光素酶活性显著增强(P0.01);与LPS组比较,SB组荧光素酶活性显著降低(P0.01)。【结论】HMGB1基因启动子报告基因构建成功,LPS可以增强其表达,SB则可以抑制LPS刺激下的HMGB1启动子表达增强,可为下一步筛选具有调控HMGB1启动子活性的药物奠定基础。     

APP/PS1双转基因老年性痴呆小鼠早期病理和认知行为变化

【目的】探讨APP/PS1双转基因老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠早期病理和行为学变化。【方法】选取5、7月龄的APP/PS1双转基因小鼠和非转基因小鼠,采用刚果红染色法和定量方法,并结合Morris水迷宫行为学测试,对其脑内淀粉样斑块积聚与学习记忆能力的月龄变化关系进行研究。【结果】(1)7月龄的双转基因组小鼠的空间辨别学习记忆能力与非转基因组小鼠比较差异有统计学意义(P<0.05);(2)APP/PS1双转基因组小鼠在5、7月龄时海马与脑皮质均观察到明显的橘红色斑块沉积,但非转基因组小鼠海马及脑皮质均未观察到淀粉样斑块沉积。【结论】7月龄APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力下降,APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层和海马部位淀粉样斑块的早期出现随年龄依赖性增加。     

龟板有效成分抗紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞的凋亡

目的确定紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞凋亡模型,筛选抗凋亡的龟板有效成分,为进一步应用开发打下基础。方法分离培养胎鼠表皮干细胞,用流式细胞仪检测CK19和Integrin β1双标阳性细胞鉴定纯度。用紫外线直接照射细胞造成损伤模型,用龟板各成分对照培养,用流式细胞仪检测FITC-Annexin V和碘化丙锭(PI)双标,根据细胞凋亡率确定紫外线损伤模型和筛选具有抗凋亡作用的龟板有效成分。结果①第3代胎鼠表皮干细胞已达到96.57%以上纯度;②紫外线照射量为100mJ/cm2损伤15min再培养20h可获得稳定的损伤模型,总凋亡率为41.06%;③龟板有效成分2B、S6、S8、S9均有抗凋亡作用。结论龟板有效成分S8具有较好的抗紫外线损伤所致的胎鼠表皮干细胞凋亡作用,应进一步探讨其机制。     

龟板促进Parkinson病大鼠黑质骨形态发生蛋白信号分子的表达

为了进一步探讨骨形态发生蛋白(BMP)/分化抑制因子(Id)通路在龟板抗PD大鼠多巴胺能神经元凋亡中的作用,本实验用6-羟基多巴胺(6-OHDA,0.2%)于大鼠左侧黑质致密带注射2μl造成PD模型,设立正常对照组、模型组和龟板组,用免疫组织化学染色方法观察PD大鼠中脑黑质骨形态发生蛋白IB受体(BMPR-IB),Smad8和Id1阳性细胞数目;用Western-blotting检测BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ、Smad1、Smad5、Smad8和Id1蛋白表达水平的变化。免疫组化染色显示龟板组PD大鼠中脑黑质BMPR-IB,Smad8和Id1的阳性细胞数明显多于模型组(P<0.05)。Western-blotting结果显示龟板组PD大鼠中脑黑质BM-PR-IB,Smad8和Id1的蛋白表达水平高于模型组,而BMPR-IA,BMPR-Ⅱ,Smad1和Smad5没有被检测出。以上结果表明龟板能上调6-OHDA诱导的PD大鼠中脑黑质BMPR-IB,Smad8和Id1的表达,这可能是其抗PD大鼠多巴胺能神经元凋亡的分子机制。     

龟板含药血清对大鼠骨髓间质干细胞体外增殖的影响

[目的]观察益肾中药龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖的影响。[方法]使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,分别从光学显微镜下的形态学特征、免疫细胞化学染色后的MSC表型特征、四甲基偶氯唑盐(MTT)染色后MSC的吸光值以及以Brdu、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色后MSC的阳性细胞数变化等角度观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC的生长变化。[结果]不同浓度的龟板血清均以浓度依赖方式促进MSC增殖活力和增加Brdu、PCNA阳性细胞数,与对照组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。[结论]龟板血清可促进MSC的增殖而有利于细胞脱氧核糖核酸(DNA)合成,推测这可能是龟板补肾的机理之一。     

β-细辛醚抑制核转录因子Kappa B表达

目的β-细辛醚对核转录因子κB(nuclear factor Kappa B,NF-κB)表达的影响,为进一步应用开发打下基础。方法培养RAW264.7细胞,脂质体LipofectamineTM2000转染NF-κB启动子双荧光素酶报告基因分析系统Luc2P/NF-κB-RE/Hygro,0.2μg/mL LPS刺激,以15、150μmolβ-细辛醚干预,孵育24 h后检测相对荧光素酶活性;按以上分组干预培养RAW264.7细胞,采用蛋白免疫印迹法检测NF-κB蛋白表达。结果荧光素酶报告基因结果表明,β-细辛醚有抑制NF-κB启动子活性作用,且随剂量增大抑制作用增强;蛋白免疫印迹法结果表明,β-细辛醚有抑制NF-κB蛋白表达作用,且随剂量增大抑制作用增强。结论β-细辛醚能抑制NF-κB转录与表达,可能有较强的抗炎作用。     

龟板抗Parkinson病大鼠多巴胺能神经元凋亡的作用

为探讨补肾中药龟板抗Parkinson病大鼠模型黑质神经元凋亡的作用,本研究用6-羟基多巴胺(6-OHDA,0.2%)于大鼠左侧黑质致密带注射2μl造成Parkinson病(PD)模型,同时设立龟板组(灌胃补肾中药龟板2g/次,2次/d,连续12周)、模型组和正常对照组,观察其行为改变,再用HE、TH染色或DIG-dUTP染色观察黑质神经元的变化,免疫组化染色检测Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果显示:龟板组PD大鼠的旋转行为改善明显,黑质致密部的TH染色阳性神经元增多,DIG-dUTP染色阳性率降低,Bcl-2蛋白表达增加和Bax蛋白表达减少。本文结果提示,长期龟板治疗对PD模型大鼠多巴胺能神经元凋亡具有明显的保护作用,且该作用可能与龟板升高Bcl-2和降低Bax的表达有关。     

牛珀至宝微丸对内毒素休克肾组织诱生型一氧化氮合酶表达的影响

目的　探讨牛珀至宝微丸对内毒素休克肾组织iNOS表达的作用。方法　静脉注射内毒素 (LPS) 1 5mg/kg、腹腔注射D 氨基半乳糖糖 (D Ga1N) 10 0mg/kg造成内毒素休克模型 ,用牛珀至宝微丸干预处理 ,免疫组化方法检测诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)在肾组织内的表达。结果　牛珀至宝微丸可以使肾内iNOS表达减弱 ,肾损伤减轻。结论　牛珀至宝微丸可以减轻内毒素休克造成的肾损伤 ,这种保护作用可能是通过调节肾组织NOS表达而产生的