缺氧导致体外培养乳鼠心肌细胞凋亡的研究

目的:通过体外培养乳鼠心肌细胞模拟缺氧模型,探讨心肌细胞缺氧损伤时是否发生心肌细胞凋亡。方法:取(1~3)d新生SD乳鼠心肌进行心肌细胞培养,采用模拟缺氧模型,通过HE染色、流式细胞仪等手段观察检测细胞凋亡的改变。结果:在本实验心肌细胞缺氧模型中,HE染色可见凋亡细胞体积变小,胞核浓缩,胞质嗜酸性增强。流式细胞仪检测出明显的凋亡峰。结论:本实验培养乳鼠心肌细胞缺氧模型可导致心肌细胞凋亡,可通过HE染色观察凋亡细胞形态学的变化,流式细胞术检测细胞DNA含量而对凋亡细胞进行定量分析。     

LePtin对缺氧诱导胎肺H型上皮细胞凋亡的影响及机制

目的观察瘦素(LEP)对缺氧诱导胎鼠肺Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)凋亡的拮抗作用,并探讨其机制.方法采用改良免疫黏附法原代培养胎鼠AECⅡ细胞,并用SP-A免疫细胞化学法和透射电镜进行鉴定;用含5 mmol/L连二亚硫酸钠(Na2S2O4)培养液培养AECⅡ细胞12 h建立缺氧诱导细胞凋亡模型,处理组含不同浓度LEP(100-1 600 μg/L);噻唑兰(MTT)比色法检测细胞存活情况;流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期;蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测凋亡蛋白caspase 3的表达.结果采用免疫黏附法获得高纯度原代培养的AECⅡ细胞,免疫细胞化学法示SP-A阳性表达,电镜下可见细胞内特征性板层小体;5 mmol/L Na2S2O4能诱导AECⅡ细胞凋亡和caspase 3活化,LEP(100-1 600 μg/L)能减轻Na2S2O4所致的细胞损伤,表现为AECⅡ存活率提高、增殖指数(PI)增高及凋亡峰下降、细胞形态恢复和caspase 3活化受抑制.结论LEP可拮抗缺氧所致AECⅡ细胞凋亡,这可能与其促使细胞周期从G1期进入S期及抑制凋亡蛋白caspase 3活化有关.     

玉竹提取物B抗肿瘤机制的初步研究

目的：研究玉竹提取物B(the extract B of Polygonsham odoratum,EB-PAOA)对S—180荷瘤鼠细胞因子产生水平的影响及诱导人结肠癌CL-l87细胞调亡的作用，以初步探讨EB-PAOA的抗肿瘤作用机制。方法：采用MTT法，检测EB-PAOA对S—180荷瘤鼠产生IL-2、IFN—γ、IL-1和TNF—α等细胞因子水平的影响；体外培养人结肠癌CL-l87细胞株，用MTT法测定EB-PAOA对CL-187细胞的抑制率；用电镜观察并确认有无凋亡细胞；通过流式细胞仪检测凋亡率。结果：EB-PAOA处理后的荷瘤鼠产生IL-2、IL-1和TNF—α的能力均有所增强；EB-PAOA能抑制CL-l87细胞的增殖；电镜下可见到大量凋亡细胞；流式细胞仪DNA直方图上出现了凋亡峰，凋亡率呈时间依赖性。结论：EB-PAOA抗肿瘤的作用机制可能是通过促进荷瘤鼠脾细胞分泌IL-2以及腹腔巨噬细胞分泌IL-1和TNF—α增强细胞免疫功能并具有直接诱导肿瘤细胞调亡作用而实现的。     

芒果苷对缺氧损伤骨髓间充质干细胞凋亡的保护

背景：缺氧性死亡限制了细胞移植和组织再生中细胞的应用。 目的：观察芒果苷对氯化钴作用下骨髓间充质干细胞缺氧损伤性凋亡的保护作用。 方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用氯化钴建立细胞缺氧模型,以芒果苷对缺氧损伤下的骨髓间充质干细胞进行保护,通过MTT实验观察芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的保护作用;采用流式细胞仪检测芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧保护的细胞凋亡及线粒体膜电位检测结果。 结果与结论：氯化钴能显著抑制大鼠骨髓间充质干细胞的生长,并且呈明显的剂量依赖关系。氯化钴200 μmol/L处理细胞12 h,诱导细胞凋亡率为(42.49±3.96)%;处理细胞24 h,诱导细胞凋亡率为(46.37±4.49)%,随着芒果苷浓度的增加,大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的凋亡率逐步减少(P < 0.01),芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤具有保护作用,且呈浓度依赖性。结果提示,氯化钴缺氧模型能成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,具有剂量准确可控、无特殊设备要求、易操作等优点;芒果苷能有效抑制缺氧损伤时骨髓间充质干细胞的凋亡,对细胞具有保护作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

鼠胎肝干细胞生物学特性与人端粒酶反转录酶基因介导的影响

背景：研究表明,感染人端粒酶反转录酶基因后的干细胞具有稳定表达高水平端粒酶活性,且能使细胞增殖旺盛,这为建立基因工程的永生化干细胞系奠定了基础。 目的：探讨人端粒酶反转录酶基因感染对体外培养鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。 方法：体外培养鼠胎肝干细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染,用RT-PCR、Western blot检测鼠胎肝干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：与对照组、空载病毒组相比,基因感染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞减少,S期细胞数增多。结果表明以重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

不同低氧浓度对神经干细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨不同的低氧浓度对离体培养胎鼠脑皮质神经干细胞( NSCs)的增殖与凋亡的影响.方法 体外不同低氧条件下(3％ O2、5％ O2、10％ O2)培养胎鼠皮质来源的细胞,实验组分别分为低氧1、3、5d组,常氧组为对照.免疫细胞化学染色鉴定NSCs,BrdU掺入法检测实验组NSCs的增殖:流式细胞仪检测实验组NSC...     

Cx43基因干扰对鼠胎肝干细胞培养的优化效应

背景：胎肝干细胞具有分化成肝细胞、胆管细胞的潜能,参与肝脏的修复与重建,是肝细胞的重要来源,但是人体的胎肝干细胞含量极少,如何获取一定数量和较高纯度的胎肝干细胞是目前研究的热点。目的：构建能有效抑制大鼠胎肝干细胞Cx43基因表达的siRNA载体,探讨抑制 Cx43表达对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法：体外培养鼠胎肝干细胞,设计及合成靶向Cx43的siRNA序列(Cx43-siRNA)以及阴性对照序列(NC-siRNA),采用电转法转染大鼠胎肝干细胞,即为实验组和对照组,未转染的胎肝干细胞为空白组。应用real-time PCR和Western blot法检测转染前后鼠胎肝干细胞Cx43基因和蛋白的表达;细胞生长曲线、CCK-8法观察细胞生长增殖情况;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论：转染Cx43-siRNA后,实验组与对照组、空白组相比Cx43基因和蛋白水平表达均明显降低,细胞的生长速度明显增快,G₀/G₁期细胞减少,S期细胞数增多,差异有显著性意义(P < 0.05),结果表明通过电转法转染靶向Cx43的siRNA能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

脯氨酸羟化酶抑制剂可抑制小鼠骨髓间充质干细胞凋亡

背景：脯氨酸羟化酶抑制剂能够通过稳定低氧诱导因子使其下游基因表达上调,进而对细胞凋亡发挥调控作用。 目的：观察脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸对无血清培养引起的小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响。 方法：分离传代培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞。分别应用无血清(无血清对照组)及含体积分数10%胎牛血清(正常对照组)的DMEM培养基培养小鼠骨髓间充质干细胞24,48,72 h,实验组在无血清对照组的基础上给予1 mmol/L的二甲基乙二酰基甘氨酸。 结果与结论：实验所获的细胞通过流式细胞仪细胞表型鉴定和三系分化鉴定证实为骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示,与无血清对照组比较,实验组骨髓间充质干细胞凋亡率明显降低(P < 0.01)。说明脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸可拮抗血清剥夺引起的骨髓间充质干细胞凋亡。     

大鼠胎儿表皮干细胞的分离鉴定和体内分化

目的探索一种简单而又高效的分离大鼠胎儿表皮干细胞方法,以及观察其在体内环境中的分化潜能。方法采集ED14、ED16、ED18及ED20不同发育阶段的SD大鼠胎儿皮肤,HE染色观察其结构。鼠尾胶原快速黏附法筛选胎鼠表皮细胞,在无血清培养基(K-SFM)中进行培养。免疫组织化学方法检测CK-19和1β-整合素表达情况。同时,也对细胞周期和细胞增殖能力进行检验。经荧光染料(PKH26)标记过的胎鼠表皮干细胞与多孔凝胶海绵结合,然后植入大鼠肾被膜下进行诱导分化。结果在ED18之前皮肤表皮和真皮尚未充分完成分化。使用快速黏附法能够有效的从ED18胎鼠皮肤分离到表皮干细胞。获得的细胞CK19和1β整合素呈阳性表达,细胞周期分析显示,细胞呈慢周期性,移植体在肾被膜下分化并展现典型的表皮样结构。结论表皮干细胞存在于早期发育皮肤中,但在ED18才能使用快速黏附法分离到表皮干细胞。此时的胎鼠表皮干细胞具有向表皮分化的能力。     

骨形态发生蛋白2对14 d胎鼠端脑神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响

背景：骨形态发生蛋白2可能是参与胆碱能神经元前体细胞分化的细胞外调控因子。 目的：观察骨形态发生蛋白2在孕14 d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元过程中的作用。 方法：取孕14 d胎鼠端脑,用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板,细胞原代培养24 h后半量换液,加入10 μg/L骨形态发生蛋白2继续培养。 结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性,获取的神经干细胞纯度大于99%;ChAT免疫荧光鉴定骨形态发生蛋白2可以将孕14 d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元,细胞纯度大于97%。     

ERK信号通路对人表皮干细胞增殖分化的影响

BACKGROUND:Epidermal stem cells (ESCs) cultured in vitro can easily become differentiated and aged, but have limited proliferation ability. These characters limit the application and development of ESCs in skin tissue engineering. Increasing understanding of the regulatory mechanism of ESCs proliferation and differentiation would lay the theoretical foundation for the clinical application of ESCs. OBJECTIVE:To identify the role of the ERK pathway in the proliferation and differentiation of ESCs. METHODS:ESCs were isolated and cultured in vitro. The activity of the ERK pathway was blocked by PD98059 and the activation of the ERK pathway was conducted by PMA or transfecting MEK1 recombinant plasmid to enable the overexpression of MEK1. The effect of activation or blockage of the ERK pathway on the proliferation and colony formation ability of ESCs was detected by MTT and colony formation assay, respectively. The expression of ESCs markers K19 and β1-integrin and differentiated cell marker K10 was detected by western blot. RESULTS AND CONCLUSION:When the activity of the ERK pathway was blocked by PD98059, the proliferation and colony formation abilities of ESCs were inhibited and the differentiation was enhanced. On the contrary, activating the ERK pathway by PMA or upregulation of MEK1 enhanced the proliferation and colony formation abilities of ESCs but inhibited the cell differentiation. These results indicate that the ERK pathway plays an important role in the proliferation and differentiation of ESCs.     

龟板活性成分对骨髓问充质干细胞中Id1表达的影响

地观察龟板活性成分对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1（inhibitorofdifferentiation1,Id1）的作用。方法将构建成功的PGL3．Id1启动子用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,龟板9种活性成分（s1-s9：十六酸甲酯（s1）、十六酸（s2）、十六酸乙酯（s3）、十八酸甲酯（s4）、十八酸（s5）、十八酸乙酯（s6）、甾醇（s7）、十四酸甾醇酯（S8）、4-甾酮（s9））30μg／mL分别作用于转染后的BMSCs36h,萤光素酶报告基因检测各活性成分对Id1表达的影响。选取对Id1作用明显的s2、S3、s6、s8、S9,RT．PCR检测对Id1表达的影响。将各活性成分按不同的方式配伍,30μg／mL的终浓度作用于转染后的BMSCs36h,萤光素酶报告基因检测各配伍对Id1表达的影响。结果s6、s8、s9促进了BMSCs中Id1的表达;S2、S3抑制了BMSCs中Id1的表达;S6、s8、s9之间的配伍可以促进Id1的表达;S2、S3及其与其他成分之间的配伍降低了Id1的表达。结论S6、S8、s9为龟板中促进BMSCs增殖的活性成分：s2、S3为抑制BMSCs增殖的活性成分。龟板对MSCs的作用是各成分相互作用的结果,既促进了BMSCs增殖,又避免了细胞的过度增殖。     

白藜芦醇拮抗卵泡颗粒细胞氧化应激的损伤

目的 探讨白藜芦醇是否可以拮抗过氧化氢诱导的卵泡颗粒细胞氧化应激损伤。方法 收集体外受精/单精子卵泡浆内注射（IVF/ICSI）患者捡卵后卵泡液中的颗粒细胞并进行培养。将培养后的颗粒细胞分为4组：对照组,损伤模型组,10 μmol/L白藜芦醇组和50 μmol/L白藜芦醇组。采用CCK-8法测定细胞活性,硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量,水溶性四氮唑-1（WST-1）法测定超氧化物歧化酶（SOD）水平,竞争ELISA 法测定孕酮分泌量,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞仪测定细胞凋亡,Western blotting测定Bcl-2、Caspase-3和沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）蛋白表达。结果 与对照组比较,损伤模型组的细胞活性、SOD水平、孕酮分泌量和Bcl-2蛋白表达均明显降低,而MDA含量、细胞凋亡率和Caspase-3凋亡蛋白表达均明显增加（P<0.05）。与损伤模型组比较,10 μmol/L白藜芦醇组各项指标未显示出统计学差异;而50 μmol/L白藜芦醇组的细胞活性、SOD水平、孕酮分泌量和Bcl-2及SIRT1蛋白表达均明显升高,MDA含量、细胞凋亡率和Caspase-3凋亡蛋白表达均明显下降（P<0.05）。结论 50 μmol/L白藜芦醇可以通过增加SIRT1的活性,增强颗粒细胞的抗氧化及抗凋亡能力,改善颗粒细胞的功能。     

Interrelationships between cornification and cell migration of fetal rat epidermis in vitro

Samples of dorsal skin were obtained from 18-, 19- and 20-day rat fetuses. Comparative developmental studies were carried out from a portion of the samples, while the remaining samples were cultured for four days in a medium containing tritiated thymidine and studied autoradiographically. At 18 days the epidermis contained a periderm, a stratum intermedium and a stratum basale. By 19 days the strata granulosum and spinosum had developed. At 20 days, a stratum corneum was present. Cultured samples of 18-day fetal rat skin resembled those that developed in utero with respect to time, whereas, the samples of 19- and 20-day fetal rat skin developed a more extensive stratum corneum, fewer keratohyalin granules, and a more condensed stratum Malpighii. Autoradiographic studies were made to determine the time taken for cells to migrate from the stratum basale to the outermost layer of the stratum granulosum (transit time). A similar “transit time” was noted for the three fetal ages studied. The rates of cell migration varied. The results of this study suggest that the extent of cornification impedes cell migration by providing a physical resistance or barrier against the outward forces presumably exerted by the division of basal cells.     

参麦注射液对急性缺氧-复氧心肌细胞凋亡的影响

目的：观察参麦注射液对急性缺氧-复氧后心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。 方法： 采用原代培养的大鼠心肌细胞，通过化学缺氧法使细胞缺氧5 min，再恢复氧供应15 min，复制心肌细胞缺氧-复氧（anoxia-reoxygenation, A/R）模型。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡百分率；Fluo-3负载激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内钙离子水平。 结果： A/R组心肌细胞凋亡百分率明显高于正常组，细胞内平均钙离子荧光强度也显著强于正常组（P<0.01）。参麦注射液组细胞凋亡率显著小于A/R组，同时细胞内钙超载也明显轻于A/R组（P<0.01）。 结论： 参麦注射液能有效抑制缺氧-复氧心肌细胞的凋亡，这种保护作用的机制之一可能是通过减轻细胞内Ca2+超负荷实现的。     

龟板抗Parkinson病大鼠多巴胺能神经元凋亡的作用

为探讨补肾中药龟板抗Parkinson病大鼠模型黑质神经元凋亡的作用,本研究用6-羟基多巴胺(6-OHDA,0.2%)于大鼠左侧黑质致密带注射2μl造成Parkinson病(PD)模型,同时设立龟板组(灌胃补肾中药龟板2g/次,2次/d,连续12周)、模型组和正常对照组,观察其行为改变,再用HE、TH染色或DIG-dUTP染色观察黑质神经元的变化,免疫组化染色检测Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果显示:龟板组PD大鼠的旋转行为改善明显,黑质致密部的TH染色阳性神经元增多,DIG-dUTP染色阳性率降低,Bcl-2蛋白表达增加和Bax蛋白表达减少。本文结果提示,长期龟板治疗对PD模型大鼠多巴胺能神经元凋亡具有明显的保护作用,且该作用可能与龟板升高Bcl-2和降低Bax的表达有关。     

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点,近年来已成为干细胞研究的热点。 目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性,探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。 方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术,鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性,并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。 结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CD105,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录-聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG,羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和 KLF4,两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8,羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8,免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14,说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性, 在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤,苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构,且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。     

An improved method for the isolation and culture of rat epidermal stem cells

The management of burns and injuries using novel treatment strategies involving epidermal stem cells (ESC) requires a better understanding of the biology of these cells, in particular, their isolation and the maintenance of their unique characteristics in culture. The purpose of this study was to describe an improved method for isolating putative ESC from fetal rat skin and to maintain them long term in culture. Single ESC suspensions were obtained from fetal rat skin by enzyme digestion containing 0.5% neutral protease. The target cells were harvested by rapid adherence on type IV collagen plates and were cultured in complex DMEM. After primary isolation, cells were continuously cultured in K-serum free medium. After reaching 70-80% confluence, the cells were digested with 0.25% trypsin at 37°C for 5-10 minutes, and passaged at a ratio of 1:2. The cultured ESC showed good growth, resulting in cell viability of over 98%. Four days later, clones containing 100-200 cells were detected, showing cobblestone-like characteristics. The rapidly adherent cells were positive for keratin 15, 19 and P63. Eighty three percent of cells expressed β1 integrin. The growth-curve showed that the rapidly adherent cells were in the exponential growth phase. The protocol described in this paper provides a simplified and effective method to isolate and maintain long-term culture of epidermal stem cells from fetal rat skin. This method should be valuable for isolating and studying ESC from various transgenic rat lines that are currently available.     

大鼠触须毛囊干细胞的分离培养和鉴定

背景：毛囊干细胞在体内膀胱及周围组织环境作用下有可能向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化,成为目前研究较新的干细胞之一。 目的：建立一种高效简单的分离培养和鉴定毛囊干细胞的方法。 方法：取大鼠触须部皮肤组织,体式显微镜下分离出毛囊组织,中性蛋白酶Ⅱ与胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液“两步酶法”消化;所得细胞悬液中添加含体积分数10%胎牛血清的角质细胞无血清培养基,Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞,20 min以内贴壁的细胞作为实验组,未贴壁的细胞作为对照组;待筛选后的细胞生长至70%~80%汇合后,进行传代培养。 结果与结论：筛选后的细胞形态均匀一致,折光性强,呈典型的“铺路石状”。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞仪检测实验组CD34和β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,对照组相应为(19.20±11.53)%和(63.57± 14.42)%,两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明联用显微分离技术、二步酶法及差速贴壁法筛选可以获得纯度较高的毛囊干细胞。CD34和β1整合素表达是较理想的鉴定方法。