新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR5的体外研究

目的探讨体外培养神经干细胞是否表达趋化因子受体CCR5。方法采用无血清方法分离、培养新生大鼠海马神经干细胞，细胞免疫荧光方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）表达及干细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力；后通过细胞免疫荧光及逆反转录酶一聚合酶链反应（RTPCR）方法检测神经干细胞表达趋化因子受体CCR5的情况。结果体外培养新生大鼠海马神经干细胞呈nestin阳性，可分化为神经丝蛋白200（NF200）阳性神经元、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞及2，3-环核苷酸磷酸二酯酶（CNP）阳性少突胶质细胞，CCR5细胞免疫荧光及RT-PCR证实神经干细胞表达趋化因子受体CCR5。结论新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CCR5，为进一步研究其体内、外迁移提供理论依据。     

星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的实验研究

目的探讨星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的影响。方法分离和培养新生大鼠脑组织的神经干细胞;采用差速贴壁法和振荡法分离纯化星形胶质细胞,用免疫细胞化学染色法,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞,进行细胞的纯度鉴定;将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,免疫荧光法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果纯化的星形胶质细胞GFAP抗体标记阳性,细胞纯度达98%;星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,NSE阳性细胞及TH阳性细胞明显多于对照组(P<0·05)。结论星形胶质细胞源性因子可快速诱导神经干细胞向神经元细胞、包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生。     

液压性脑损伤后室下区神经干细胞的分离培养与鉴定

目的分离液压性脑损伤室下区巢蛋白（nestin）和胶质酸性纤维蛋白（GFAP）阳性（nestin^＋／GFAP^＋）共存细胞进行培养和诱导分化，观察其分裂、增殖和分化能力，以阐明损伤反应性星形胶质细胞增生过程中nestin^＋／GFAP^＋共存细胞是否具有神经干细胞特性。方法用液压冲击法建立动物模型，分离损伤成年SD大鼠室下区nestin^＋／GFAP^＋共存细胞，制成单细胞悬液，培养和诱导分化，以免疫荧光化学方法对原代和传代培养形成的神经球以及原代和传代培养诱导分化的细胞进行鉴定。结果结果显示培养及传代的细胞不断分裂增殖，可以形成悬浮生长nestin阳性的神经球；神经球诱导分化后可以分化为少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞。结论成年大鼠液压性脑损伤后分离的室下区细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，是中枢神经系统神经干细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CX3CR1的体外研究

目的 探讨体外培养神经干细胞是否表达趋化因子受体CX3CR1.方法 采用无血清方法分离、培养新生大鼠海马神经干细胞,细胞免疫荧光方法检测神经干细胞标志巢蛋白(nestin)表达及干细胞多向分化为神经元及胶质细胞的能力,后通过细胞免疫荧光及RT-PCR方法检测神经干细胞表达趋化因子受体CX3CR1的情况.结果 体外培养新生大鼠海马神经干细胞呈nestin阳性.可分化为神经丝蛋白200(NF200)阳性的神经元、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质细胞及2',3'-环核苷酸-3'-磷酸二酯酶(CNP)阳性的少突胶质细胞,细胞免疫荧光及RT-PCR证实神经干细胞表达趋化因子受体CX3CR1.结论 新生大鼠海马神经干细胞表达趋化因子受体CX3CR1.为进一步研究其体内外迁移提供理论依据.     

成年小鼠嗅球神经干细胞的培养和鉴定

目的 建立完善的成年小鼠嗅球神经千细胞分离培养和鉴定方法,探索新的成年神经干细胞种子来源. 方法 用无血清方法 分离培养成年小鼠嗅球来源的神经干细胞;用克隆培养、5-溴2-脱氧尿嘧啶核昔(BrdU)整合的方法 检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法 检测BrdU、神经干细胞标记物巢蛋白(nestin)和SOX2、分化的细胞标记物Tuj1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、04的表达. 结果 从成年小鼠嗅球能够分离、培养出具有自我更新、增殖能力的神经球.构成神经球的细胞呈nestin和SOX2阳性,它们分化后产生TuJ1阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、04阳性的少突胶质细胞. 结论 成年小鼠嗅球存在神经干细胞,其能够在体外进行培养、增殖、分化.是神经干细胞的新的种子来源.     

体内外不同环境对大鼠胚胎神经干细胞分化的影响

目的 探讨体内外不同环境条件对大鼠胚胎神经干细胞分化影响。方法 孕龄16天的大鼠胚胎神经干细胞体外扩增后移植至大鼠脑内尾状核出血部位；同时体外将其与新生大鼠Schwann细胞共培养，应用免疫组织化学和免疫荧光方法分另检测神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性标志蛋白tubulin-β、MAP2，GFAP和GalC的表达。结果 移植到脑内的BrdU阳性细胞环绕脑出血区域分布，大部分细胞GFAP阳性，少部分细胞tubulin-β或ＧalC阳性；而与Ｓchwann细胞共培养后，神经干细胞大部分呈tubulin-β和ＭＡＰ２免疫荧光阳性，少部分呈ＧＦＡＰ或ＧalC免疫荧光阳性。结论 脑内尾状核出血环境诱导神经干细胞主要分化成神经胶质细胞；而体外与Ｓchwann细胞共培养主要诱导其分化成神经细胞。     

神经干细胞向γ-氨基丁酸能神经元的诱导分化

目的探索海马神经干细胞在特定条件下分化成γ-氨基丁酸能神经元的情况,为颞叶癫痫的细胞替代学治疗奠定基础。方法新生大鼠海马组织中的神经干细胞在体外增殖后,加入特定的细胞因子进行诱导,使其向γ-氨基丁酸能神经元分化,对分化的细胞进行神经元烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白（MAP-2）、γ-氨基丁酸（GABA）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和半乳糖脑苷脂酶（GalC）免疫荧光染色鉴定,判断其分化成γ-氨基丁酸能神经元的情况。结果海马神经干细胞诱导贴壁后即发生分化,其中几乎全部分化成神经元（γ-氨基丁酸能神经元）,只有极少的胶质细胞和少突胶质细胞形成。结论从海马神经干细胞中几乎可以完全诱导形成γ-氨基丁酸能神经元,这为颞叶癫痫的细胞替代学治疗奠定了基础。     

成年C57小鼠脊髓神经干细胞的培养与鉴定

目的　 从成年小鼠脊髓中培养神经干细胞 ,并对其进行鉴定和诱导分化。方法　 成年C5 7小鼠 ,悬浮培养神经干细胞技术。结果　培养 1～ 2周时 ,培养液中即可出现神经干细胞克隆球。该克隆球具有很强的自我增殖能力 ,可多次传代。免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量的神经干细胞特征性的中间丝———巢蛋白(Nestin) ;经 1%胎牛血清诱导后可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特征性标志物β tubulinIII、胶质纤维酸性蛋白 (Gliafibrillaryacidicprotein ,GFAP)和RIP ,提示它们可朝神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化。 结论　 本研究结果提示正常成年C5 7小鼠脊髓中含有神经干细胞 ,在体外条件下可以大量增殖 ,经诱导后可朝神经元和胶质细胞的方向分化     

猫骨髓源性神经干细胞诱导分化的实验研究

目的探讨猫骨髓分离培养、诱导分化神经干细胞的可行性。方法无菌条件下行骨穿,梯度密度离心获取猫骨髓基质细胞,以“神经干细胞培养基”培养,用分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果猫骨髓基质细胞在相应培养条件下能在体外培养中增殖、分化,克隆形成细胞球(或称“神经球”),这些细胞球能表达神经干细胞特异性抗原nestin,而且能进一步诱导分化出胶质样细胞和神经元样细胞,免疫细胞化学检测可见有胶质源性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原表达。结论猫骨髓基质细胞在一定条件诱导下可分化成神经胶质样和神经元样细胞。     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

Isolation of neural stem cells from the spinal cords of low temperature preserved abortuses

In the present study, we show that neural stem cells can be obtained from the spinal cords of low temperature preserved abortuses. Fourteen weeks old abortuses were stored in a refrigerator at 4 degrees C for 2 h, 6 h and 12 h before use. Neural stem cells were isolated from cervical cord, thoracic cord and lumbar/sacral cord separately and induced to differentiate with fetal bovine serum. Clonal culture was carried out to demonstrate that the isolated cells met the standard of stem cells. Fluorescent immunocytochemistry was used to examine the expression of neural stem cell marker (nestin), neuronal marker (MAP2), astrocyte marker (GFAP) and cholinergic marker (ChAT). The stem cells in different cultures were compared. As a result, neural stem cells were obtained from all the spinal cord segments with different postmortem intervals. The lumbar/sacral cord cultures gave rise to the most abundant primary neurospheres. When the preservation was prolonged to 12 h, the number of primary neurospheres decreased sharply. Neurospheres in all cultures showed nestin positive immunoreactivity and could yield astrocytes and neurons including cholinergic neurons in differential cultures. The clonal formation and phenotype capacity were similar in all cultures. In conclusion, spinal neural stem cells can be isolated from low temperature preserved abortuses and represent an alternative source for both experimentation and potential therapeutic uses.     

Neural stem cells: isolation and differentiation into cholinergic neurons

This investigation aimed to isolate neural stem cells from neonatal hippocampus and induce them to differentiate into cholinergic neurons. The isolated neural stem cells were incubated in serum-free Dulbecco's modified Eagle medium/F12 medium added with 20 ng/ml basic fibroblast growth factor and B27. The cell line isolated from the hippocampal formation of neonatal rats expressed nestin and had the potency to form clones and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Embryonic chick skeletal muscle extract was used to induce the differentiation of the neural stem cells into cholinergic neurons. Immunocytochemistry was used to detect the choline acetyltransferase antigen of cholinergic neurons for confirmation. The results showed that embryonic chick skeletal muscle extract could induce isolated neural stem cell to differentiate into a significantly larger number of cholinergic neurons than controls.     

新生大鼠全大脑组织分离诱导分化神经干细胞的体外实验

背景：神经干细胞的供体一般以胎鼠和成年鼠为主，利用细胞培养技术分离步骤较繁琐。 目的：以新生大鼠为神经干细胞供体，拟建立一种较为简便、细胞获得率较高的分离培养方法。 设计、时间及地点：以细胞为对象观察性实验，于2006-10/2007-03在重庆医科大学完成。 材料：新生1~3 d 的Wistar大鼠全大脑。 方法：以胰蛋白酶消化、无血清、悬浮培养原代细胞，并加含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液诱导其分化。 主要观察指标：应用相差显微镜观察神经干细胞的生长特点及分化后的细胞形态学变化。应用间接免疫细胞化学染色法鉴定神经干细胞及其分化后神经元和胶质细胞标志蛋白的表达。以BrdU标记神经干细胞，观察其增殖情况。 结果：新生大鼠脑组织分离的细胞具有连续传代和增殖的能力，能稳定表达神经干细胞特异性巢蛋白。诱导分化后的细胞能表达神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的特异性蛋白。 结论：从新生大鼠脑组织分离培养出的神经干细胞获得率高，保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新和多项分化潜能。     

大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究

目的建立大鼠胎脑皮质神经干细胞的培养、扩增、诱导分化及鉴定的方法。方法选取孕14d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,在无血清培养基中添加B27、碱性成纤维细胞因子、表皮生长因子,建立胚胎神经干细胞的体外培养体系,用5%的胎牛血清诱导神经干细胞分化,用免疫荧光染色技术进行对神经干细胞及诱导分化细胞的鉴定。结果原代培养的神经干细胞折光性强,培养第2d开始形成细胞集落,第3d形成大的神经球。3～5代传代的细胞生长稳定。经胎牛血清诱导后第3d开始,神经球开始向周边发出突起,悬浮的细胞开始贴壁生长。原代及传代培养的神经球表达Nestin阳性,分化细胞分别表达NSE、GFAP和GALC阳性。结论应用无血清培养技术可在体外培养、扩增出神经干细胞。5%的胎牛血清可以诱导神经干细胞向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等成熟细胞分化。     

Effects of olfactory ensheathing cells on the proliferation and differentiation of neural stem cells

BACKGROUND:Olfactory ensheathing cells can promote oriented differentiation and proliferation of neural stem cells by cell-secreted neural factors. OBJECTIVE:To observe the effect of olfactory ensheathing cells on the differentiation and proliferation of neural stem cells. DESIGN,TIME AND SETTING:Cytology was performed at the Department of Neurology,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,China,from September 2007 to October 2008. MATERIALS:Mouse anti-nestin polyclonal antibo...     

中药复方脑络欣通含药血清诱导大鼠胚胎神经干细胞增殖分化：与胎牛血清的比较

目的：比较中药复方脑络欣通药物血清与胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的差异。方法：分别采用脑络欣通药物血清和胎牛血清诱导大鼠胚胎神经干细胞增殖分化,应用相差显微镜和免疫荧光染色对其进行比较观察。结果：脑络欣通药物血清和胎牛血清均可诱导绝大多数神经干细胞分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。此外,脑络欣通药物血清还能一定程度上促进培养的神经干细胞增殖。前者诱导干细胞分化的进程比后者要慢,但其分化的神经元在细胞形态学上与发育成熟的神经元更为接近。结论：脑络欣通药物血清能够诱导神经干细胞分化,并使其分化更加成熟,且在一定程度上促进培养的神经干细胞增殖。     

脐血细胞培养前后的形态改变及神经细胞特有分子表达

目的探讨脐血单个核细胞(MNCs)培养前后的形态改变及神经细胞特有分子表达。方法采用倒置显微镜观察培养过程中脐血MNCs形态的变化,RT-PCR方法检测MNCs培养前后神经细胞标志物nestin,NF-M及MAP2mRNA的表达。结果培养前,脐血MNCs胞体小呈圆形,培养后细胞胞体变大,有突起形成,相邻细胞连接成网状,类似神经细胞。RT-PCR检测发现,培养前脐血MNCs中的nestin,NF-M及MAP2mRNA有阳性表达,在培养后表达增强。结论直接分离的脐血MNCs中存在着神经(干)细胞;培养后,出现神经元样细胞,nestin,NF-M及MAP2mRNA表达增强。     

不同方法诱导大鼠脂肪基质细胞定向分化为神经细胞的比较研究

目的 探索提高大鼠脂肪基质细胞(ADSCs)向神经细胞定向诱导分化比例的实验方法.方法 根据所采用的不同细胞诱导分化方法分为A组(直接诱导组:以含血清及神经营养因子的Neurobasal培养基直接诱导ADSCs向神经细胞分化)和B组[神经球诱导组:先以无血清Neurobasal培养基将ADSCs诱导为神经干细胞(NSCs)球,再以含血清及营养因子的Neurobasal培养基诱导神经球干细胞向神经细胞分化].通过细胞形态学观察以及免疫细胞化学检测巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、微管相关蛋白2(MAP2ab)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,鉴定细胞分化结果.结果 免疫细胞化学结果证实,两组细胞均有效表达nestin和β-tubulinⅢ.A组细胞在诱导6 h时nestin表达可达高峰(73.8%±6.5%),并很快下降(24 h为50.3%±3.8%,72 h为10.5%±3.0%),72 h后即检测不到;β-tubulinⅢ在诱导后24 h开始表达(33.5%±6.6%),1周达高峰(84.3%±33%).B组nestin的高表达持续整个神经球阶段,β-tubulinⅢ在神经球阶段有少量表达(成球后7 d为14.1%±3.3%),神经球细胞分化后其表达明显增加(分化后3 d为46.4%±6.1%);B组存由NSCs向神经细胞诱导一定时间后可检测到一定比例的MAP2ab阳性细胞(24.5%).结论 ADSCs在体外稳定扩增传代并在适宜诱导条件下,可以向神经细胞定向分化.应用神经球诱导法和直接诱导法均可得到较高比例的nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,神经球诱导组nestin表达稳定,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.     

A population of human brain parenchymal cells express markers of glial, neuronal and early neural cells and differentiate into cells of neuronal and glial lineages

Glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positive cells derived from the neurogenic areas of the brain can be stem/progenitor cells and give rise to new neurons in vitro and in vivo. We report here that a population of GFAP-positive cells derived from fetal human brain parenchyma coexpress markers of early neural and neuronal cells, and have neural progenitor cell characteristics. We used a monolayer culture system to expend and differentiate these cells. During the initial proliferative phase, all cells expressed GFAP, nestin and low levels of betaIII-tubulin. When these cells were cultured in serum and then basic fibroblast growth factor, they generated two distinct progenies: (i) betaIII-tubulin- and nestin-positive cells and (ii) GFAP- and nestin-positive cells. These cells, when subsequently cultured in serum-free media without growth factors, ceased to proliferate and differentiated into two major neural cell classes, neurons and glia. In the cells of neuronal lineage, nestin expression was down-regulated and betaIII-tubulin expression became robust. Cells of glial lineage differentiated by down-regulating nestin expression and up-regulating GFAP expression. These data suggest that populations of parenchymal brain cells, initially expressing both glial and neuronal markers, are capable of differentiating into single neuronal and glial lineages through asymmetric regulation of gene expression in these cells, rather than acquiring markers through differentiation.