抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

烧伤后大鼠骨骼肌组织泛素及泛素化蛋白表达的变化研究

为研究烧伤大鼠骼肌组织泛素（ubiquitin)及泛素化蛋白表达的变化规律，探讨烧伤后骨骼肌蛋白降解的分子机制，采用大鼠30％Ⅲ度烫伤模型，分为伤后2、6、12和24h组，每组设正常对照组，于伤后不同时间点分别测定大鼠骨骼肌孵育液中伸趾长肌蛋白降解率以及伸趾长肌组织中泛素及泛素化蛋白的表达变化。结果发现，大鼠烧伤后伸趾长肌蛋白降解率增强，尤其是肌纤维蛋白降解增强明显（P＜0．01），伤后12h增加185％，24h增加153％；伸趾长肌泛素及泛素化蛋白的表达在烧伤后各时相点均显著增加（P＜0.01)，尤以12h和24h为明显，表达增加的泛素化蛋白主要为高分子量蛋白。提示烧伤后大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢与泛素及泛素化蛋白的高表达关系密切。     

TNF对离体孵育骨骼肌的蛋白代谢与泛素系统基因表达的影响

为研究TNF-α对离体孵育骨骼肌蛋白代谢及泛素系统基因表达的影响，采用含重组大鼠TNF－α（6000U/mL)的孵育液有氧孵育大鼠伸趾长肌（EDL），对照组孵育液除不含TNF－α外其余成分与实验组相同，高效液相色谱法测定总蛋白和肌纤维蛋白的代谢率。核糖核酸印迹法检测EDL泛素mRNA和C2 mRNA的表达变化。结果显示，实验组大鼠EDL总蛋白和肌纤维蛋白分解代谢率与对照组相比差异无统计学意义，但EDL泛素mRNA（2.4kb)和C2亚基mRNA的表达较对照组分别升高约511％和56％，差异有统计学意义。提示TNF－α能与骨骼肌细胞直接发生作用，增强细胞内泛素蛋白酶体途径的活性。但TNF－α能否直接增强骨骼肌蛋白分解代谢尚有待进一步探讨。     

人睫状神经营养因子的克隆与原核表达

目的：克隆人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，并探索其在大肠杆菌中高效表达。方法：提取总ＲＮＡ，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），序列测定正确后原核表达并用制备电泳纯化。结果：克隆了人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达量至少达到２６％，制备电泳纯化后，重组蛋白纯度达到９５％。结论：从胎儿坐骨神经组织中克隆到人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，制备电泳纯化出高纯度的重组蛋白     

人工改造的A型肉毒毒素重链Hc段基因在大肠杆菌中的可溶性表达研究

目的 人工合成A型肉毒毒素Hc段基因,并在大肠杆菌中进行高效表达.方法 人工合成Hc段基因,选择宿主细胞偏爱的同义密码子替换其原有稀有密码子,使AT含量降至57.3%,然后将其克隆入pQE-60表达载体,在大肠杆菌中进行可溶性表达.结果 可溶性表达产物占细菌可溶性蛋白的11.5%左右,表达产物可被A型肉毒毒素马血清抗毒素识别.结论 成功地表达并鉴定了A型肉毒毒素Hc蛋白,为进一步进行A型肉毒毒素的疫苗或抗体研究奠定了基础.     

烫伤大鼠肿瘤坏死因子与脂多糖结合蛋白的关系及其意义

采用大鼠３５％体表面积Ⅲ度烫伤模型，探讨严重烫伤后肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）与脂多糖结合蛋白（ＬＢＰ）的关系及其意义。实验动物随机分为正常对照组、烫伤组。分别检测血浆ＴＮＦ－α含量、组织ＴＮＦ－α及脂多糖结合蛋白（ＬＢＰ）ｍＲＮＡ表达水平，结果显示，烫作后务浆ＴＮＦ－α水平迅速升高，２ｈ达高峰，８ｈ下降，组织ＴＮＦ－α与ＬＢＰｍＲＮＡ表达量较伤前显著升高，８ｈ达高峰，２４ｈ下降。相关分析显示：     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

胶质细胞源性神经营养因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：分离胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达。方法：从人多形性成胶质细胞瘤细胞株ＢＴ３２５ 中提取总ＲＮＡ ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离ＧＤＮＦ基因,构建表达载体ｐＢＶ－ＧＤＮＦ,转化大肠杆菌,温控诱导ＧＤＮＦ的表达。结果与结论：分离得到的人ＧＤＮＦ基因,在大肠杆菌中得到高效表达,表达产物占全菌总蛋白的２４．７％ ,初步纯化后纯度达９０％ 以上。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆及高效分泌表达

目的：从幽门螺杆菌（Ｈｐ）分离热休克蛋白Ａ基因，并实现在大肠杆菌中的融合分泌表达，方法：提取Ｈｐ染色体ＤＮＡ，用ＰＣＲ方法扩增ｈｓｐＡ基因。经克隆、测序后，构建融合分泌表达载体ｐＭＡＬ－ＨｓｐＡ，转化大肠杆菌，ＩＰＴＧ诱导表达。结果：分离得到了高度保守的３５４ｂｐ的ｈｓｐＡ基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的融合分泌表达。在３７℃诱导表达３ｈ后，基融合分泌表达蛋白可占细菌周质总蛋白的６６．６％。     

沙门菌属pad蛋白的原核表达及抗原性的鉴定

目的在大肠杆菌中表达沙门菌属pad蛋白,纯化后制备兔抗pad抗体。方法利用PCR方法从肠炎沙门茵中扩增出pad基因,构建pET一32a（＋）一pad重组表达质粒;将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性克隆,测序鉴定后,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间以诱导重组蛋白的表达;以纯化的pad蛋白免疫家兔,制备抗pad多克隆抗体并进行鉴定。结果与结论成功扩增得到pad基因,经双酶切和测序证实重组表达质粒构建成功,经过诱导条件的优化,在大肠杆菌中表达出相对分子质量为41×10。的目的蛋白;纯化的重组蛋白免疫家兔后,能够有效地刺激家兔产生特异性抗体,经琼脂糖双向扩散测定抗血清效价达到1：32以上。为进一步研制沙门茵属体外快速检测试剂打下了基础。     

长双歧杆菌NCC2705中胆盐水解酶基因的克隆表达及其特性的研究

目的克隆并过表达胆盐水解酶基因,研究胆盐水解酶对茵体胆盐耐受性和胆固醇降解率的影响等特性。方法采用常规原核表达方法在大肠杆菌BL21（DE3）和长双歧杆菌NCC2705中过表达胆盐水解酶基因,并进行长双歧杆菌NCC2705和pMgap—bsh／NCC2705的胆盐耐受性和降胆固醇实验。结果在大肠杆菌中成功表达了NCC2705的胆盐水解酶基因,经纯化的GST空标签和GST融合蛋白的SDS—PAGE电泳结果显示,胆盐水解酶的相对分子质量约为35×103;构建的过表达bsh的菌株pMgap—bsh／NCC2705比标准菌株NCC2705表现出了略高的胆盐耐受性和胆固醇降解率。结论所构建的高效表达胆盐水解酶菌株可能有利于提高茵体的胆盐耐受性和降胆固醇能力,益生菌的降胆固醇途径不是单一的,培养基中是否含有胆盐对胆固醇的降解率影响较大。     

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

霍乱弧菌外膜蛋白W的原核表达及抗原性分析

目的在大肠杆菌中表达霍乱弧菌种特异性外膜蛋白（Omp）W,纯化后制备检测用OmpW抗体。方法采用PCR法以霍乱弧菌基因组为模板扩增ompW基因,插入表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-32a-ompW;重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导获得目的蛋白,纯化后免疫新西兰大耳白兔,制备OmpW的多克隆抗体并进行鉴定。结果扩增得到ompW基因片段,并成功构建pET-32a-ompW原核表达系统,重组蛋白OmpW以包涵体形式高效表达;制备的OmpW抗体能与天然的O1群和O139群霍乱弧菌结合。结论霍乱弧菌OmpW可由原核系统高效表达,免疫获得的抗体具有较好的效价,为进一步制备霍乱弧菌检测用抗体奠定基础。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

E.coli BL21(DE3)磷酸转乙酰基酶缺陷变株的筛选及特性

目的：利用大肠杆菌磷酸转乙酰基酶（ＰＴＡ）缺陷变株减少工程菌乙酸的产生,以利于工程菌高密度培养及外源蛋白表达。方法：从Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）出发筛选ＰＴＡ变株,并对变株的特性进行研究。结果：筛选得到５株磷酸转乙酰基酶缺陷变株,变株的乙酸累积水平为亲株的１／５左右,最大比生长速率为亲株的２／３左右。各种有机酸（乙酸、乳酸、丙酮酸和琥珀酸）对ＢＬ２１（ＤＥ３）及其变株生长影响的考察结果显示,有机酸对Ｐ」ＴＡ变株的生长抑制曲线发生了一定变化,其中以乙酸影响的变化最为显著。低浓度乙酸对ＰＴＡ变株的生长不但不具抑制作用反而具有刺激作用、而高浓度乙酸对变株生长的抑制作用也明显减弱。     

类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

hClock-(35-47)的表达、纯化及其功能的检验

目的 构建hClock-(35-47)的表达质粒,进行诱导表达,纯化,在体外初步鉴定其跨膜功能.方法 合成hClock-(35-47)全长DNA序列,重组入pET-32a表达载体中,测序鉴定后转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,构建好重组体的表达菌株.IPTG诱导并优化表达后,以NTA-Ni亲合层析进行分离纯化,及SDS-PAGE和Western bloting鉴定.纯化鉴定后的hClock-(35-47)用FITC标记,以一定的浓度孵育体外培养的血管内皮细胞(ECV-304),荧光显微镜下观察其穿膜活性.结果 成功构建了hClock-(35-47)的表达载体,插入片断为51 bp,表达产物相对分子质量约为21 kD,经Western bloting 鉴定,与抗His-Tag抗体有特异性反应, 与培养的ECV-304孵化,显示具有穿膜功能.结论 原核表达的hClock-(35-47)仍然保留其穿膜功能,为进一步研究提供基础.