中国药用植物细胞工程研究进展（1）

中国药用植物细胞工程研究进展（１）于荣敏，张惟材，张辉沈阳药科大学药物研究所１１００１５细胞工程是应用细胞生物学的方法，按照人们的预想方案，有计划地保存、改变和创造遗传物质的技术，亦即在细胞水平上对生物体进行创造设计．由于植物的一个细胞犹如一株潜在的...     

E.coli BL21(DE3)磷酸转乙酰基酶缺陷变株的筛选及特性

目的：利用大肠杆菌磷酸转乙酰基酶（ＰＴＡ）缺陷变株减少工程菌乙酸的产生,以利于工程菌高密度培养及外源蛋白表达。方法：从Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）出发筛选ＰＴＡ变株,并对变株的特性进行研究。结果：筛选得到５株磷酸转乙酰基酶缺陷变株,变株的乙酸累积水平为亲株的１／５左右,最大比生长速率为亲株的２／３左右。各种有机酸（乙酸、乳酸、丙酮酸和琥珀酸）对ＢＬ２１（ＤＥ３）及其变株生长影响的考察结果显示,有机酸对Ｐ」ＴＡ变株的生长抑制曲线发生了一定变化,其中以乙酸影响的变化最为显著。低浓度乙酸对ＰＴＡ变株的生长不但不具抑制作用反而具有刺激作用、而高浓度乙酸对变株生长的抑制作用也明显减弱。     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

破伤风毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的 一株抗破伤风毒素鼠源单克隆抗体的制备与鉴定.方法 从实验室前期以破伤风类毒素为抗原筛选得到的6株稳定细胞株中选取4E12进行制备及鉴定,首先将4E12细胞株扩大培养后腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,经Protein G柱和PD10脱盐柱两步纯化鼠源单抗;其次通过SDS-PAGE电泳检测抗体纯度并通过分型试剂盒鉴定抗体轻重链亚型,免疫印迹法鉴定抗体结合区域及表位类型,非竞争ELISA法测定抗体亲和力常数以及小鼠中和实验评价抗体中和活性.结果 获得能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株4E12,其细胞培养上清效价为4×103,抗体轻重链分别为κ型和IgG1型,CDR3序列分别为SQSTHVPPT和ARKGTGTGFNY;4E12腹水抗体效价为3.2×104,抗体经纯化后纯度＞95％,以线性表位与TeNT/Hc结构域特异性结合,两者的亲和力常数为3.6×10-10 mol/L,小鼠中和实验结果显示,4E12抗体可部分中和破伤风毒素.结论 筛选到一株高亲和力的鼠源单抗,为破伤风毒素检测及中和抗体研发奠定了基础.     

中国药用植物细胞工程研究进展（2）

中国药用植物细胞工程研究进展（２）于荣敏，张惟材，张辉沈阳药科大学药物研究所１１００１５１单倍体技术及应用人十年代以来，我国学者主要对名贵药材人参花药培养进行了研究。杜令阁［１］（１９８４）用ＭＳ，Ｂ５，Ｎ６，改良怀特、改良尼许五种基本培养基，分别附...     

甲基营养菌MP688甲醛脱氢酶的表达、纯化及酶活性质

目的 克隆甲基营养菌MP688甲醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)基因adhA,在大肠杆菌中表达、纯化,并研究其酶学性质.方法 PCR扩增甲醛脱氢酶基因adhA,构建表达载体pTIG-AdhA,在BL21(DE3)中诱导表达,经Ni+亲和层析纯化,利用AHMT法进行体外酶学性质分析.结果 成功构建甲醛脱氢酶表达载体,在大肠杆菌中AdhA表达量达总蛋白的50%以上,其中大部分表达产物可溶,纯化得到纯度为95%的甲醛脱氢酶.甲醛脱氢酶能以甲醛为底物,最适pH为7.0,最适反应温度为30℃,室温保存6 d后酶活约保留60%.结论 在大肠杆菌中实现了甲基营养菌甲醛脱氢酶的可溶表达,在所考察的底物中,甲醛为该酶的最适底物.