艾洛替尼耐药的卵巢癌SKOV3细胞系的建立及其耐药特性

目的通过体外建立艾洛替尼(Erl)耐药的人浆液性卵巢癌细胞系SKOV3/Erl,并探讨其耐药机制,为卵巢癌靶向性治疗的耐药性研究提供细胞模型及依据。方法 采用逐步递增联合大剂量冲击法诱导细胞,取对数生长期的SKOV3细胞,从Erl 1μmo.lL-1开始处理,以Erl 2,4,8,16和25μmo.lL-1反复换液传代,最终维持浓度为10μmo.lL-1,共诱导10个月。取SKOV3和SKOV3/Er1细胞,加入不同浓度艾洛替尼、紫杉醇、米托蒽醌、表柔比星、拓扑替康、长春新碱和甲氨蝶呤等药物,作用72 h,磺酰罗丹明B染色法检测耐药倍数。流式细胞术检测SKOV3细胞和SKOV3/Er1细胞的细胞周期。Western印迹法检测Erl刺激对敏感和耐药细胞中表皮生长因子受体(EGFR)相关信号通路产生的变化;流式细胞术检测SKOV3/Er1细胞表面ATP结合盒(ABC)转运蛋白中P糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的表达以及Toll样受体4(TLR4)的表达;检测脂多糖(LPS)刺激对紫杉醇耐受的SKOV3/Erl细胞的敏感度。结果 Erl对SKOV3细胞的IC50为(9.54±1.04)μmol.L-1,而对SKOV3/Erl细胞的IC50为(21.63±1.05)μmo.l L-1,耐药倍数约为2.26,诱导成功的SKOV3/Erl对紫杉醇、长春新碱、米托蒽醌和甲氨蝶呤的耐药倍数均在3倍以上。与SKOV3细胞相比,SKOV3/Erl细胞G0/G1期比例上升,S期比例下降,G2/M期几乎无变化。Erl刺激后,与SKOV3细胞相比,SKOV3/Erl细胞中p-HER1,p-ERK与p-AKT水平上调。SKOV3/Erl细胞膜上Pgp,BCRP和MRP1表达有微弱上调,而TLR4显著上调;脂多糖可强烈刺激SKOV3/Erl细胞增殖,并且对紫杉醇杀伤起到保护作用,而亲本细胞则相对不敏感。结论 成功建立了对Erl耐受的人卵巢癌耐药细胞SKOV3/Erl。其表现出的多药耐药机制可能与TLR4蛋白表达上调有关。     

酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼耐药K562细胞系的建立及其耐药特征

目的建立酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(STI-571)耐药K562细胞系并研究其耐药特征。方法采用含递增浓度伊马替尼的培养基培养K562细胞,诱导耐伊马替尼K562细胞系(K562R)。通过细胞生长曲线、细胞形态和细胞凋亡分析确定耐药细胞是否形成;采用MTT法观察耐药细胞的耐药谱;通过半定量PCR和Western印迹法检测相关基因及蛋白的表达,并通过基因测序分析K562R细胞B细胞受体-c-Abelson(BCR-ABL)激酶区基因序列。结果成功地将伊马替尼高敏感的K562细胞诱导成K562R,伊马替尼抑制K562和K562R细胞存活的IC50值分别为0.01±0.00和(2.35±0.01)μmol·L-1,耐药倍数为235.0倍。K562R具有一定的交叉耐药性,对高三尖杉酯碱、长春新碱和对柔红霉素的耐药倍数分别为13.2,63.2和11.8倍。K562R可对抗伊马替尼诱导的细胞凋亡,伊马替尼1.0μmol·L-1培养24 h K562和K562R细胞凋亡率分别为72.1%和18.2%。耐药形成机制研究表明,与K562细胞相比,K562R细胞BCR-ABL基因、多药耐药基因(MDR)和p-糖蛋白基因(p-GP)的表达均明显增加。此外,K562R细胞BCR-ABL基因的第696位发生A→C点突变,该位点突变导致激酶区第231位氨基酸由赖氨酸取代原有的天冬酰胺。结论成功建立了耐伊马替尼细胞系K562R。K562R细胞具有交叉耐药性和对抗伊马替尼诱导的细胞凋亡等特征。K562R细胞BCR-ABL基因序列发生点突变,MDR和p-GP等基因表达亦明显升高。     

5-氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体的抗耐药作用及部分机制研究

目的研究5氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体(5FuGCL)体外对耐5FuHepG2细胞株的抑制作用并对其抗耐药机制进行探讨。方法在建立耐5Fu的HepG2细胞株模型的基础上,采用MTT法检测5FuGCL对其的抑制作用。另外,通过高效液相法(HPLC)检测细胞内液的药物含量、免疫组化法检测胸苷酸合酶(TS)的表达、化学法检测NO含量等研究其抗耐药作用机制。结果5FuGCL(75,150,300,600,1200μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞株有明显的抑制作用,IC50为158.6μmol·L-1,远小于游离5Fu(400.9μmol·L-1);5FuGCL(300μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞的抑制作用随时间的延长而增强,其中(24～48h)的抑制作用明显强于相同浓度的游离5Fu。5FuGCL(300μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu比较,能明显增加药物进入HepG2细胞内液的程度;5FuGCL(75,300,1200μmol·L-1)既可明显降低TS的表达,又可显著增加NO的含量,且5FuGCL(300,1200μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu相比,其作用明显增强。结论5FuGCL有明显的抗5Fu耐药作用,这可能是通过增加细胞内液5Fu的含量,抑制TS的表达和增加NO含量实现的。     

GCS基因与MDR1基因在肝癌细胞多药耐药中的相关性研究

目的观察葡萄糖神经酰胺合酶(GCS)基因高表达对肝癌细胞HepG2内多药耐药基因(MDR1)表达的影响,探讨GCS基因参与肝癌多药耐药的作用机制。方法脂质体法将GCS基因真核表达质粒pEGFP-GCS导入肝癌细胞株HepG2中,应用G418筛选培养,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞GCS mRNA和MDR1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测细胞GCS蛋白和P-糖蛋白(P-gp)的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测基因转染前后阿霉素对HepG2细胞半数抑制浓度(IC50)的变化。结果转染后HepG2细胞内GCSmRNA和蛋白的表达水平显著提高(P<0.05),而MDR1mRNA及P-gp的表达水平亦显著提高(P<0.05);同时,MTT法检测结果显示GCS基因转染后HepG2细胞对阿霉素的耐药性显著提高(P<0.05),IC50从(6.2±0.4)μg/ml上升到(11.6±1.0)μg/ml。结论高表达GCS可以上调HepG2细胞中MDR1的表达,使HepG2细胞发生多药耐药。     

舒尼替尼用于对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的作用研究

目的:探讨舒尼替尼用于对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的效果及其作用机制。方法:选取2017年1月至2019年1月内蒙古自治区人民医院收治的非小细胞肺癌患者75例,对其肿瘤组织进行切除,提取肿瘤细胞后进行原代培养,提取细胞总RNA并测定其纯度以及浓度。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测舒尼替尼对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用;采用Western blot法检测舒尼替尼处理后对吉非替尼耐药细胞中的多药耐药(MDR)、核因子κB(NF-κB)、血管内皮生长因子(VEGF)及血小板衍生生长因子(PDGF)蛋白表达水平。结果:1.5μmol/L的舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)为(30.57±1.86)μmol/L,明显低于0μmol/L舒尼替尼对吉非替尼耐药细胞的IC50[(45.62±1.79)μmol/L];舒尼替尼可显著增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性,可降低吉非替尼的IC50;此外,舒尼替尼还可明显降低耐药细胞中的MDR、NF-κB、VEGF及PDGF蛋白表达水平,其中PDGF蛋白表达水平降低44.38%,影响最为显著。结论:吉非替尼与舒尼替尼具有协同作用,舒尼替尼可逆转对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的疗效,为临床应用提供更多理论依据,其机制仍需进一步研究。     

双氢青蒿素通过PI3K/Akt通路逆转肺癌顺铂耐药A549/DDP细胞的分子机制

摘要：目的:研究双氢青蒿素通过磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）通路逆转肺癌顺铂耐药A549/DDP细胞的分子机制。方法:体外培养人肺癌耐顺铂株（A549/DDP）,给予不同浓度双氢青蒿素(20,40,80,160,200,250,300μmol·L-1)处理48 h后,通过MTT法检测双氢青蒿素对A549/DDP细胞增殖影响,选取双氢青蒿素最佳实验浓度及在不同浓度DDP(0,20,40,60,80,100μmol·L-1)作用下观察并计算顺铂对A549/DDP细胞IC50和双氢青蒿素对A549/DDP逆转倍数;通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中凋亡相关因子B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）及PI3K/Akt通路相关蛋白PI3K、AKT、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的表达。结果:随双氢青蒿素浓度升高,细胞增殖抑制率依次升高（P<0.05）,且具有浓度依赖性,IC10（32.07±1.04）μmol·L-1是双氢青蒿素为最佳逆转耐药浓度;随DDP浓度的升高,双氢青蒿素A549/DDP细胞增殖抑制率随之升高（P<0.05）,DDP+双氢青蒿素组顺铂对A549/DDP的IC50为（26.42±1.23）μmol·L-1,顺铂组为（58.16±1.32）μmol·L-1,双氢青蒿素的逆转耐药倍数为2.21;与对照组相比,DDP组、双氢青蒿素组、DDP+双氢青蒿素组细胞凋亡率、caspase-3表达显著升高（P<0.05）,Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt表达显著降低（P<0.05）;与DDP组、双氢青蒿素组相比,DDP+双氢青蒿素组细胞凋亡率、caspase-3表达显著升高（P<0.05）,Bcl-2、PI3K、p-Akt/Akt表达显著降低（P<0.05）。结论:双氢青蒿素通过抑制PI3K/Akt通路促进A549/DDP细胞凋亡,在一定程度上可逆转肺癌A549/DDP细胞株对顺铂的耐药性。     

白鲜碱对HepG2细胞的毒性作用及其机制

目的研究白鲜碱的肝细胞毒性作用及其毒性机制。方法白鲜碱2.5～800μmol·L-1与HepG2细胞作用24 h,用MTT法检测细胞存活率并计算IC50值,用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞膜损伤。白鲜碱25～100μmol·L-1与HepG2细胞作用4,24或48 h,用试剂盒方法分别检测细胞培养液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷氨酰转肽酶(GGT)活性。用倒置显微镜观察细胞形态变化;激光共聚焦扫描显微镜检测细胞线粒体膜电位的变化。结果白鲜碱25～800μmol· L-1与HepG2细胞作用24 h对HepG2细胞存活的抑制作用随着浓度的增加而降低(r=0.965,P<0.05),IC50值为(283±27)μmol·L-1。与溶剂对照组相比,白鲜碱12.5～50μmol·L-1作用24 h,HepG2细胞LDH释放率显著升高(P<0.01)。白鲜碱100和200μmol·L-1可引起HepG2细胞形态发生明显变化,细胞皱缩脱落,细胞数目减少,并使HepG2细胞线粒体膜电位下降(P<0.05,P<0.01)。白鲜碱100和200μmol·L-1与HepG2细胞作用24 h可使细胞培养液中ALT和AST活性显著升高,并呈浓度依赖性(r=0.995,P<0.05和r=0.996,P<0.05),线粒体膜电位亦明显下降(r=0.978,P<0.05)。与溶剂对照组相比,白鲜碱100和200μmol·L-1与HepG2细胞作用4 h,细胞培养液中GST活性明显升高(P<0.05);作用24 h,GST活性升高呈浓度依赖性(r=0.987,P<0.05)。白鲜碱200μmol· L-1作用48 h导致HepG2细胞培养液中GGT活性升高(P<0.05)。结论较高浓度的白鲜碱(≥100μmol· L-1)具有潜在的肝毒性,细胞膜损伤和线粒体损伤可能是其肝毒性作用机制之一。     

ZNF300基因在肝癌耐药细胞HepG2/VCR中的表达及功能初探

目的建立人肝癌HepG2/VCR耐药细胞株,检测ZNF300基因在HepG2/VCR中的表达并初步分析其在肝癌多药耐药(MDR)中发挥的功能。方法采用体外低浓度梯度递增的诱导方法建立长春新碱(VCR)获得性HepG2/VCR耐药细胞株。MTT法检测确定HepG2/VCR耐药细胞株对VCR的耐药性,用Western blot方法检测人锌指蛋白ZNF300基因编码的ZNF300及多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)在HepG2和HepG2/VCR细胞中的表达差异;在HepG2/VCR细胞中转染ZNF300基因正向或反向cDNA质粒后,MTT法检测VCR对耐药细胞IC50值的变化,Westernblot方法检测细胞内P-gp表达的影响。结果 MTT检测确认HepG2/VCR耐药细胞构建成功,Western blot检测发现耐药细胞中ZNF300及P-gp的表达相对于HepG2细胞明显增高。在HepG2/VCR细胞中转染正向ZNF300 cDNA质粒后,MTT和Western blot检测发现ZNF300过表达可使VCR对耐药细胞的IC50值增高,并使细胞内P-gp表达上调;在转染反向cDNA质粒Knockdown ZNF300基因表达后得到相反的结果。结论 ZNF300基因在HepG2/VCR耐药细胞中表达明显增高,并能通过上调耐药蛋白P-gp的表达促进肝癌细胞耐药性,可以作为逆转肝癌多药耐药的分子作用靶点。     

瓦他拉尼对乳腺癌耐药蛋白介导的肿瘤多药耐药的逆转研究

目的观察新型激酶抑制剂类抗癌药瓦他拉尼(vatalanib)逆转肿瘤细胞多药耐药(MDR)的效果,研究其对乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)的作用,探讨其作用机制。方法应用MTS法或SRB法检测瓦他拉尼对耐药细胞与敏感细胞的细胞毒性和逆转MDR的效果;分别以罗丹明(Rh-123)、米托蒽醌(MX)、阿霉素(ADR)为P-gp、BCRP、MRP1的荧光底物,应用流式细胞术检测该药对P-gp、BCRP、MRP1外排功能的影响;应用Western blot检测该药对耐药细胞中BCRP蛋白表达水平的影响,并研究其对细胞增殖相关信号分子的影响;应用qRT-PCR检测其对耐药细胞中BCRP基因表达水平的影响;通过超速离心法制备BCRP转运蛋白的粗膜,检测瓦他拉尼对BCRP的ATPase活性的影响。结果无毒剂量的瓦他拉尼(5μmol·L-1)可有效逆转BCRP高表达的肿瘤细胞株HEK293/ABCG2对MX、ADR和托泊替康(TOPT)的耐药,而对P-gp高表达的肿瘤细胞株K562/A02和MRP1高表达的肿瘤细胞株HEK293/ABCC1的耐药无逆转作用。该药能够下调耐药肿瘤细胞的BCRP基因和蛋白的表达水平,并具有时间和剂量依赖效应,但对BCRP外排MX的功能无明显抑制作用。该药可以激活BCRP的ATPase活性,但并不改变BCRP的构象,对耐药和敏感细胞中AKT和ERK的表达及其磷酸化水平也均无明显影响。结论瓦他拉尼可有效、特异地逆转BCRP介导的肿瘤MDR,其机制可能是通过下调耐药肿瘤细胞中BCRP基因和蛋白的表达来达到逆转MDR的效果。     

浙贝母总生物碱对人肺腺癌A549/顺铂细胞耐药性的逆转作用(英文)

目的研究浙贝母总生物碱(TAF)对人肺腺癌A549/顺铂(DDP)细胞DDP耐药性的逆转作用。方法①离体实验:采用MTT法观察TAF(12.5～200mg·L-1)对A549和A549/DDP细胞的毒性作用;采用MTT法检测TAF 9mg·L-1对A549/DDP细胞耐药的逆转作用,同时设环孢菌素A(Cys A)1mg·L-1和汉防己甲素(Tet)1mg·L-1为阳性对照;实时荧光定量PCR检测A549/DDP细胞多药耐药基因1(MDR1)mRNA相对表达;Western蛋白免疫印迹法检测A549/DDP细胞P-糖蛋白(P-gp)相对表达。②在体实验:制备BALB/c裸鼠A549/DDP移植瘤模型,随机分为模型对照、DDP 5mg·kg-1、TAF2 mg·kg-1、DDP 5 mg·kg-1+TAF 0.5,1和2 mg·kg-1联用组,每两天ip给予DDP,每天ig给予TAF,持续13d,检测移植瘤体积和质量的变化。结果 TAF作用72 h抑制A549和A549/DDP细胞存活的IC50值分别为141±5和(298±22)mg·L-1;IC10值分别为15.3±1.9和(9.0±1.2)mg·L-1。DDP 0.01～100mg·L-1与TAF 9 mg·L-1合用后,DDP抑制A549/DDP细胞存活的IC50值由(14.06±3.72)mg·L-1降至(0.79±0.14)mg·L-1,抑制A549细胞存活的IC50值无明显变化;TAF对A549/DDP细胞DDP耐药性的逆转倍数为17.80倍,高于Cys A(10.16倍)和Tet(14.05倍)。TAF可明显降低A549/DDP细胞MDR1 mRNA及P-gp相对表达(P<0.01)。DDP 5mg·kg-1体内抑瘤率为49.9%,与TAF 2mg·kg-1合用后抑瘤率增至67.4%(P<0.01)。结论 TAF在体内外均可逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,可降低MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达。     

去甲斑蝥素诱导人卵巢癌SK-OV-3细胞发生有丝分裂期阻滞与凋亡

目的考察去甲斑蝥素(NCTD)对人卵巢癌SK-OV-3细胞生长的抑制作用,探究其诱导细胞发生有丝分裂期阻滞及凋亡的过程及相关性。方法 NCTD 30,60,120和240μmol.L-1分别作用人卵巢SK-OV-3细胞24,48和72 h后,MTT法检测细胞存活率;NCTD 60μmo.lL-1分别作用SK-OV-3细胞0,6,12和24 h后,流式细胞术测定细胞周期的变化;NCTD 60μmol.L-1分别作用SK-OV-3细胞0,6,12和24 h,倒置显微镜下检测其对细胞形态学变化的影响;Giemsa染色检测细胞核的变化;间接免疫荧光术结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测细胞内微管分布及有丝分裂期纺锤体形成的影响。NCTD 60μmol.L-1分别作用12和36 h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况;再将NCTD 60μmo.lL-1作用12 h后的细胞,采用温和的机械振荡法分离为悬浮细胞和贴壁细胞,继续作用24 h,流式细胞术及Giemsa染色检测分析两个时相两种细胞凋亡的影响。结果 MTT结果显示,NCTD 30～240μmol.L-1对SK-OV-3细胞的生长抑制作用存在明显的时间(P<0.05)和浓度依赖性(P<0.05);NCTD作用SK-OV-3细胞24,48和72 h的IC50分别为(261.3±2.4)μmo.lL-1,(48.3±1.7)μmol.L-1和(10.9±1.0)μmol.L-1。NCTD 60μmol.L-1分别作用于SK-OV-3细胞0,6,12和24 h,SK-OV-3细胞逐渐表现出G2/M期阻滞,呈时间依赖性;倒置相差显微镜下观察,NCTD引起SK-OV-3细胞逐渐收缩变圆,与周围细胞分离;Giemsa染色可见处于有丝分裂期的细胞显著增多,多个核细胞比例增多;免疫荧光染色发现,NCTD组细胞的微管系统受到干扰,有丝分裂期细胞纺锤体形成异常。NCTD作用细胞12和36 h凋亡率分别达20.4%和62.3%;将NCTD作用12 h的细胞,人工振荡分离为悬浮细胞和贴壁细胞,检测凋亡情况,同时检测继续作用24 h后两组细胞凋亡情况,发现处于有丝分裂间期的SK-OV-3细胞凋亡率大于处于有丝分裂期的细胞。结论 NCTD主要通过诱导人卵巢癌SK-OV-3细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡抑制细胞生长。干扰细胞有丝分裂过程中微管的组装和纺锤体的形成可能是NCTD诱导SK-OV-3细胞M期阻滞的原因之一。NCTD诱导的SK-OV-3细胞发生凋亡可不依赖细胞M期阻滞。     

注射用丹参总酚酸(冻干)对人CYP450酶和P-糖蛋白体外抑制作用及对大鼠CYP1A2和CYP3A体内诱导作用(英文)

目的探讨注射用丹参总酚酸(冻干)(SLI)对人CYP450酶和P-糖蛋白体外抑制作用以及对大鼠CYP1A2和CYP3A体内诱导作用。方法①应用P450-GloTMCYP450检测试剂盒,通过化学发光法测定SLI和经典抑制剂对细胞色素P4501A2(CYP1A2),CYP2D6,CYP3A4,CYP2C19和CYP2C9的IC50值,通过比较SLI和经典抑制剂对相应细胞色素P450亚型的IC50值来判断SLI对人CYP450酶的体外抑制作用。②Wistar大鼠分别iv给予SLI 3,10和30 mg·kg-1和诱导剂苯巴比妥钠20 mg·kg-1,采用探针底物法,通过比较代谢产物的生成速率来评价SLI对大鼠CYP1A2和CYP3A的诱导作用。③应用ATP酶检测试剂盒,通过化学发光法测定ATP酶活性来评价SLI是否为P-gp的底物或抑制剂。结果①CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A4抑制剂的IC50与SLI对其的IC50进行比较(CYP1A2:0.12μmol·L-1vs 840μmol·L-1;CYP2C9:3.362μmol·L-1vs 704μmol·L-1;CYP2C19:3.236μmol·L-1vs 306μmol·L-1;CYP2D6:0.117μmol·L-1vs 2660μmol·L-1;CYP3A4:0.078μmol·L-1vs 1780μmol·L-1)。②与空白对照组(86.4±6.3)nmol·g-1.min-1相比,SLI 3,10和30 mg·kg-1组CYP1A2活性分别为83.4±6.6,82.5±4.0和(83.4±6.6)nmol·g-1.min-1。与空白对照组(16.1±0.9)nmol·g-1.min-1比较,SLI 3,10和30 mg·kg-1组CYP3A活性分别为15.7±0.6,15.9±0.7和(15.9±1.0)nmol·g-1.min-1,无显著性差异。③以临床血药浓度为依据设计的一系列浓度的SLI 0.0002,0.0006,0.002,0.006,0.017,0.052,0.156和0.468 g.L-1的ATP酶活性分别与空白对照组进行比较(5.8,5.3,5.8,5.5,5.8,5.2,,5.8,5.3,vs 5.75μmol·g-1.min-1),无显著性差异。结论SLI临床给药剂量既不能体外抑制人CYP1A2,CYP2D6,CYP3A4,CYP2C19和CYP2C9酶活性,也不能诱导大鼠CYP1A2和CYP3A,同时也不是P-gp的体外抑制剂或底物。     

胡桃醌及其与顺铂联用对宫颈癌HeLa细胞存活和凋亡的影响

目的探讨胡桃醌及其与顺铂联合用药对宫颈癌HeLa细胞存活和凋亡的影响。方法体外培养人宫颈癌HeLa细胞,加入胡桃醌10～200μmo.lL-1或者胡桃醌20μmo.lL-1+顺铂20μmo.lL-1继续培养8 h或24 h,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,用MTT法测定细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞早期凋亡率。结果胡桃醌10,20,50,100和200μmo.lL-1与HeLa细胞作用24 h,随着胡桃醌浓度的增加,光镜下HeLa细胞逐渐变小、变圆;HeLa细胞存活率明显降低,分别由对照组的(100.0±0.0)%降低至(87.2±5.6)%,(66.2±4.8)%,(54.5±4.9)%,(42.5±6.4)%和(32.0±2.2)%(P<0.05,P<0.01);HeLa细胞G2/M期百分率逐渐增加,分别由对照组的(7.5±1.2)%增加到(12.9±1.2)%,(16.2±2.8)%,(23.6±3.9)%,(34.2±4.2)%和(52.6±7.8)%(P<0.05,P<0.01)。胡桃醌联合顺铂作用24 h,光镜下脱壁细胞增加,细胞形态变圆,较胡桃醌和顺铂单用组更加明显;联合用药组细胞存活率为(35.0±6.1)%,较胡桃醌和顺铂单用组〔(78.2±12.5)%和(58.5±10.9)%〕明显降低(P<0.01)。胡桃醌联合顺铂作用8 h,HeLa细胞早期凋亡率为(24.6±5.7)%,高于胡桃醌和顺铂单用组〔(6.7±1.5)%和(0.4±2.8)%〕(P<0.01)。结论胡桃醌可抑制HeLa细胞存活,促进HeLa细胞凋亡,与顺铂联合使用具有协同作用。     

选择性环氧化酶2抑制剂NS-398对胃癌细胞AGS增殖的抑制作用

目的观察选择性环氧化酶2(COX-2)抑制剂NS-398对胃癌细胞AGS增殖的抑制作用,并探讨其相关机制。方法 NS-398 25,50和100μmol·L-1作用于AGS细胞0～48 h,用CCK-8法检测细胞存活率。NS-398 50μmol·L-1作用于AGS细胞48 h,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测Notch信号通路相关基因的表达,Western印迹法检测Notch胞内结构域(NICD)及下游靶基因NF-κB和毛蛋白和断裂1增强子(Hes-1)蛋白表达。结果 NS-398 25,50和100μmol·L-1能抑制胃癌细胞AGS增殖,并呈时间(r时间=-1.00,P=0.003,50μmol·L-1)和浓度(r浓度=-0.999,P=0.027,48 h)依赖性。NS-39850μmol·L-1作用48 h,AGS细胞凋亡率为(20.1±3.5)%,比正常对照组(3.5±1.4)%明显增加(P<0.05);Notch信号通路受体Notch1和Notch2及Notch信号通路配体δ样1(DLL1)和锯齿状1(JAG1)mRNA表达无明显变化,Notch下游靶基因Hes-1和NF-κB mRNA表达较正常对照组明显减少(P<0.05);NICD,Hes-1和NF-κB蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论选择性COX-2抑制剂NS-398可能通过抑制Notch信号途径抑制胃癌细胞AGS增殖。     

雪胆素乙通过破坏微丝结构和促进p21~(Cip1)表达抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖

目的分析雪胆素乙(CuⅡb)对人前列腺癌PC-3细胞增殖及细胞周期的影响,探讨其作用机制。方法 MTS法检测CuⅡb 0.064～200μmol·L-1作用48 h后PC-3细胞增殖;CuⅡb 2和20μmol·L-1作用24 h,相差显微镜观察细胞形态;CuⅡb 2和20μmol·L-1作用48 h,流式细胞术分析细胞周期分布;免疫荧光染色分析CuⅡb 20μmol·L-1分别作用1,4和24 h后微丝和微管细胞骨架变化;免疫印迹法测定CuⅡb20μmol·L-1分别作用1,4和24 h后G肌动蛋白、F肌动蛋白、p21Cip1及细胞周期蛋白A,B1,E和D1的表达。结果 CuⅡb以浓度依赖方式抑制PC-3细胞的增殖(r=0.9817,P<0.05)。CuⅡb 20μmol·L-1作用48 h,使细胞周期阻滞于G2/M期,从溶剂对照组的(27.7±1.5)%上升为(45.3±1.8)%(P<0.01),相差显微镜见细胞发生明显收缩。CuⅡb 20μmol·L-1作用24 h,使G肌动蛋白水平显著下降,F肌动蛋白发生严重聚集(P<0.05),而对微管只有轻微影响。与溶剂对照组相比,CuⅡb 20μmol·L-1作用24 h后,细胞p21Cip1表达明显升高,细胞周期蛋白A表达显著下调,其他细胞周期蛋白表达上调(P<0.05)。结论 CuⅡb能明显抑制人前列腺癌PC-3细胞的增殖,其机制可能是通过诱导肌动蛋白聚集,破坏微丝骨架,促进抑癌因子p21Cip1表达,阻滞细胞周期的进程。     

氟哌啶醇对斑马鱼胚胎的神经毒性作用

目的探讨用斑马鱼制备帕金森病(PD)动物模型的可能性。方法每组500枚1 hpf受精卵(培养1 h的受精卵)分别加入10 ml氟哌啶醇(Hal)0.27,0.54,1.08,2.16和4.32μmo.lL-1,于3,12,24,48,72,96和120 h显微镜下观察胚胎发育,统计胚胎的孵化率、畸变率和死亡率;免疫组织化学染色法观察96 hpf幼斑马鱼脑部多巴胺(DA)能神经元面积。孵育5 d后,分别将Hal 0.54和1.08μmo.lL-1组的一半幼鱼转移至左旋多巴20 mmo.lL-1中孵育2 d,记录5 min幼鱼游泳速度。结果与正常对照组相比,Hal 0.54,1.08,2.16和4.32μmol.L-1孵育120 h,斑马鱼胚胎的孵化率明显降低〔(81±4)%,(56±5)%,(31±4)%和(8±3)%vs(94±2)%〕(P<0.01),胚胎发育迟缓。孵育96 h时斑马鱼胚胎LC50为1.31μmo.lL-1。免疫组织化学染色结果显示,与正常对照组相比,Hal 0.54,1.08和2.16μmol.L-1组幼鱼DA能神经元面积分别从(10 460±734)μm2减少至7237±1054,5044±389和(3342±320)μm2(P<0.01);Hal 0.54,1.08和2.16μmol.L-1组7 dpf幼鱼游泳速度从(1.94±0.21)mm.s-1下降至0.96±0.17,0.64±0.16和(0.38±0.15)mm.s-1(P<0.01),并出现僵直和侧翻等PD症状,转移至左旋多巴20 mmol.L-1中2 d后,Hal 0.54和1.08μmol.L-1组游泳速度恢复至1.56±0.31和(1.23±0.29)mm.s-1(P<0.01)。结论 Hal使斑马鱼产生类似哺乳动物的PD行为表现,左旋多巴能够改善PD样行为表现,说明斑马鱼有可能用来制备PD实验模型。     

高效液相色谱法测定吡美拉唑血药浓度及其药代动力学

目的 建立测定吡美拉唑血药浓度的高效液相色谱(HPLC)方法,并初步考察其在人体内的药代动力学特性。方法 受试者口服吡美拉唑10 mg后,分别于给药前,给药后0.5, 1, 1.5, 2, 4, 8, 12, 21, 36, 48, 60和72 h采集血样,通过HPLC吡美拉唑的血药浓度,并应用3P87软件拟合并计算药代动力学参数。结果 吡美拉唑的线性范围为25~4000 μg·L^-1,最低检测浓度为25 μg·L^-1,回收率95.2%~107.7%,日内精密度均<6.9%,日间精密度<10.2%。吡美拉唑的主要药代动力学参数:t_1/2为(22.58±1.59)h, AUC_0-72为(29 089±8886)μg·h·L^-1, Cl/F为(338.9±114.0)L·h^-1, t_max为(2.67±1.54)h, c_max为(1585±469)μg·L^-1。结论 吡美拉唑在人体内吸收快,半衰期较长,有效作用时间长,疗效好。     

卡托普利对动脉粥样硬化家兔血管内皮功能的保护作用及其机制

目的探讨卡托普利对动脉粥样硬化(AS)家兔血管内皮功能和形态的保护作用及其机制。方法采用高脂、高胆固醇饲料饲养家兔制备AS模型的同时口服给予卡托普利8 mg·kg-1,每天1次,连续12周;HE染色观察血管组织形态,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL);高效液相色谱测定血清非对称性二甲基精氨酸(ADMA)浓度;用重组编码人类二甲基精氨酸-二甲胺水解酶2(hDDAH2)基因的腺病毒感染AS家兔离体胸主动脉环2 h,检测对乙酰胆碱累积浓度诱导的最大舒张反应(Emax)、半数有效量(EC50)及DDAH活性。结果与正常组比较,高脂模型家兔胸主动脉内膜和中膜增厚,血清TC,TG和LDL水平升高;血清ADMA浓度升高至(2.24±0.28)μmol·L-1(P<0.01);血管壁DDAH活性降至(0.048±0.007)U·g-1蛋白(P<0.01);Emax降低至(56±8)%(P<0.01),EC50升高至(158±52)nmol·L-1(P<0.01)。与AS模型组比较,卡托普利治疗组血管内膜增厚减轻,血脂无明显降低,血清ADMA浓度显著降低至(1.37±0.23)μmol·L-1(P<0.01),血管DDAH活性增加至(0.084±0.013)U·g-1蛋白(P<0.01),内皮依赖性血管舒张功能改善,Emax增加至(88±4)%(P<0.01),EC50降低至(90±35)nmol·L-1(P<0.01)。AS模型血管转染DDAH2基因后,血管Emax回升至(88±4)%,EC50降低至(98±42)nmol·L-1,DDAH活性升高至(0.112±0.017)U·g-1蛋白,与卡托普利治疗组相似。结论卡托普利对AS家兔血管形态和内皮功能具有明显保护作用,其机制可能与增加血管DDAH活性,降低内源性ADMA浓度有关。