短发夹RNA对前列腺癌细胞中PIM-1基因沉默效应的研究

目的:探讨脂质体介导的短发夹RNA(shRNA)对前列腺癌细胞中PIM-1基因表达的影响.方法:构建3种针对PIM-1 mRNA不同靶点的shRNA重组质粒表达载体,并转染前列腺癌PC-3细胞.分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Westernblot)检测转染后细胞中PIM-1 mRNA及蛋白的表达情况.结果:转染48 h后,3种PIM-1基因靶向性shRNA表达质粒均可抑制PC-3细胞中PIM-1 mRNA和蛋白的表达,其中靶向PIM-1 mRNA第707-725位和1080-1098位序列的重组质粒干扰效果更显著.结论:本研究所构建的PIM-1 shRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制前列腺癌细胞中PIM-1的表达,为下一步研究奠定了基础.     

MCHR1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建有效针对小鼠黑色素浓集激素受体1(melanin-concentrating hormone receptor 1,MCHR1)的shRNA(small hairpin RNA)真核表达载体。方法设计合成3条小鼠MCHR1基因的shRNA序列以及1条无同源性的shRNA序列作为阴性对照,与质粒重组构建sh-MCHR1干扰载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定;脂质体法转染小鼠3T3-L1细胞后观察MCHR1 mRNA和蛋白表达的变化。结果经菌液PCR及DNA测序鉴定表明各shRNA载体构建成功;转染3T3-L1细胞后,与空载体组相比,阴性对照组MCHR1 mRNA和蛋白的表达均无明显差异,但实验组3种干扰载体均能显著抑制MCHR1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05),且3种载体的抑制程度有一定的差异,以sh-MCHR1-1载体沉默效果最佳。结论 sh-MCHR1干扰载体构建成功,为进一步探究MCHR1与肥胖症之间的关系奠定了实验基础。     

靶向Ccndl基因的siRNA对大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的 探讨靶向Cendl基因小干扰RNA(siRNA)对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LECs)Ccndl mRNA和周期蛋白D1表达及细胞增殖的抑制作用.方法 合成3条靶向大鼠Ccndl基因的siRNA(si-Ccndl-1,si-Ccndl-2,si-Ccndl一3),LipofectamineTM2000转染体外培养的大鼠LECs,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测Ccndl mRNA和周期蛋白D1表达变化,筛选最有效siRNA序列.MTT法连续测定转染最有效siRNA序列后24、48、72、96和120 h细胞增殖情况.结果 与对照组相比,3条siRNA均能不同程度地抑制Ccndl mRNA和周期蛋白D1的表达,以si-Ccndl-3最为有效(P<0.05).与对照组比较,si-Ccndl-3转染后24 h开始明显发挥对细胞增殖的抑制作用,并持续至120 h以后(P<0.05).结论 靶向Ccndl的siRNA能有效降低大鼠LECsCcndl mRNA和周期蛋白D1蛋白表达,抑制LECs增殖.     

靶向Ccnd1基因的siRNA对大鼠晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的探讨靶向Ccnd1基因小干扰RNA(si RNA)对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LECs)Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达及细胞增殖的抑制作用。方法合成3条靶向大鼠Ccnd1基因的siRNA(si-Ccnd1-1,si-Ccnd1-2,si-Ccnd1-3),LipofectamineTM2000转染体外培养的大鼠LECs,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1表达变化,筛选最有效si RNA序列。MTT法连续测定转染最有效si RNA序列后24、48、72、96和120 h细胞增殖情况。结果与对照组相比,3条si RNA均能不同程度地抑制Ccnd1 mRNA和周期蛋白D1的表达,以si-Ccnd1-3最为有效(P<0.05)。与对照组比较,si-Ccnd1-3转染后24 h开始明显发挥对细胞增殖的抑制作用,并持续至120 h以后(P<0.05)。结论靶向Ccnd1的si RNA能有效降低大鼠LECsCcnd1 mRNA和周期蛋白D1蛋白表达,抑制LECs增殖。     

shRNA沉默elF4E基因表达对人喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的 构建靶向真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)的shRNA表达载体,观察eIF4E表达抑制对喉癌细胞生物学行为的影响.方法 根据人eIF4E mRNA序列设计并构建2个靶向人eIF4E基因的shRNA真核表达载体(pSilencer4.1-sl和psilencer4.1-s2);然后以脂质体转染的方法将shRNA表达质粒转染至人喉癌细胞系Hep-2,经G418筛选出稳定转染的阳性细胞.分别通过反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting技术对构建成功的2个shRNA干扰质粒进行有效性筛选,分析其eIF4E mRNA及蛋白表达水平,并筛选出表达抑制最强的稳定转染喉癌细胞系(Hep-2-s2).通过噻唑蓝(MTT)试验检测Hep-2-s2细胞的体外增殖活性,流式细胞仪技术(FCM)检测其细胞周期和凋亡变化情况.结果 经双酶切证实转录shRNA的目的 基因片段已成功克隆入pSilencer4.1-CMVneo真核表达载体中,经测序证明插入序列完全正确;eIF4E-shRNA2可以显著下调eIF4E mRNA及蛋白表达水平;eIF4E基因的表达下调明显抑制Hep-2细胞的体外增殖(P＜0.05);Hep-2-s2细胞的Go/G1期细胞比例显著增加了(14.7±1.1)%,而S期细胞比例减少了(13.2±1.6)%(P＜0.05);Hep-2-s2的细胞凋亡率显著增加到(18.3±1.7)%(P＜0.05).结论 shRNA介导的eIF4E基因表达下调可显著降低喉癌细胞的增殖活性,同时诱导其细胞周期阻滞和凋亡率增加,为喉癌基因治疗筛选出了新的靶点.     

STK15基因RNA干扰真核表达载体的构建及对人结肠癌细胞侵袭的影响

目的 构建STK15基因特异的RNA干扰（RNAi）真核表达质粒,将其转染人结肠癌细胞SW480后,观察对STK15基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞侵袭能力的影响.方法 设计并合成能表达小发夹结构RNA （shRNA）的DNA序列,退火后与载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建重组表达载体pGPU6/GFP/NeoSTK15 shRNA,转化DH5α菌株后挑选阳性克隆,提取质粒进行序列测定.脂质体介导重组质粒转染人结肠癌SW480细胞,于转染后24h和48 h通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测STK15基因的表达,并通过细胞体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭能力.结果 测序证实插入pGPU6/GFP/Neo载体的DNA序列、方向和位点均正确.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15 shRNA质粒转染细胞24h和48 h后,STK15基因的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,且呈现时间依赖性,STK15 mRNA水平分别下调80％和98％,蛋白水平分别下调40％和80％.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15shRNA质粒转染细胞的侵袭能力分别下降约67％和89％.结论 成功构建了针对STK15基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制STK15基因的表达和细胞的侵袭能力,为进一步研究STK15基因功能以及探讨结肠癌治疗的新途径奠定了基础.     

短发夹RNA沉默YAP表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖和凋亡的影响

目的本实验通过短发夹RNA(shRNA)抑制Yes相关蛋白(YAP)基因的表达,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721的增殖、凋亡和周期影响。方法以人YAP mRNA编码区中的4条序列作为RNA干扰靶点,分别构建4个真核表达载体质粒YAP-shRNA-1、YAP-shRNA-2、YAP-shRNA-3、YAP-shRNA-4,用阳离子聚合物转染法瞬时转染,筛选出2个干扰效果较好的质粒,将它们瞬时转染肝癌细胞SMMC-7721,应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测SMMC-7721细胞中YAP在mRNA和蛋白水平表达的变化。噻唑蓝(MTT)法检测转染后细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡和周期的变化。结果转染后293T细胞中shRNA-YAP-2组与shRNA-YAP-4组YAP mRNA表达明显降低,在SMMC-7721中shRNA-YAP-2组与shRNAYAP-4组的YAP mRNA及蛋白表达水平分别为(0.871±0.081,0.106±0.013)和(1.010±0.097,0.192±0.013),与未转染组(2.399±0.148,0.372±0.007)比较差异有统计学意义(P<0.01)。MTT显示,shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4组细胞生长明显抑制,但未出现阻滞;流式细胞仪分析显示,shRNA-YAP-2组和shRNA-YAP-4组细胞凋亡率分别为(12.0±0.81)%和(5.03±1.01)%,明显高于空质粒组的(2.89±0.08)%(P<0.01)。细胞被阻滞在G2期,G0/G1期出现DNA亚二倍体峰。结论运用shRNA干扰技术,可以有效地干扰肝癌SMMC-7721细胞YAP的表达并能降低YAP的生成,抑制SMMC-7721细胞的增殖和促进细胞的凋亡。     

结肠癌转移相关基因1在食管癌细胞中的作用

目的 探讨结肠癌转移相关基因1 (MACC1)在食管癌细胞株Eca-109中的作用及其可能机制.方法 体外培养Eca-109细胞,并分为MACC1 shRNA转染重组质粒组(A组)、转染空质粒阴性对照组(B组)和Eca-109细胞空白组(C组).采用RT-PCR和Western blot法分别检测MACC1、c-MET mRNA和蛋白表达,Transwell和划痕实验分别观察转染前后Eca-109细胞侵袭和迁移能力的变化.结果 与B、C组相比,A组MACC1、c-MET mRNA和蛋白表达下调,Eca-109细胞侵袭和迁移能力降低(P＜0.05).结论 下调MACC1表达能明显抑制食管癌细胞的侵袭和转移能力,可能是通过调节下游基因c-MET表达实现的.     

RNA干扰靶向cyclin D1基因对K562细胞化疗增敏的研究

目的 cyclin D1基因在细胞周期调控中起关键性作用.研究表明其过表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关;并且与肿瘤细胞对化疗药物抗拒性有关.抑制Cyclin D1蛋白表达可达到化疗增敏作用.本研究利用RNA干扰(RNAi)技术体外观测其对K562细胞cyclin D1基因的沉默效应及增强阿霉素(ADM)对K562细胞毒性作用.方法 体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,通过壳聚糖介导转染K562细胞,Western blot分析检测转染前后Cyclin DI蛋白表达变化,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率的影响以及MTT法检测K562细胞对ADM敏感性的变化.结果 构建靶向cyclin D1基因的shRNA表达质粒(pshRNA-419和pshRNA-575)经壳聚糖转染后,能显著抑制cyclin D1基因表达;影响K562细胞周期分布,诱导细胞凋亡,并降低ADM半数抑制浓度,提高了化疗敏感性.而设计一碱基突变的序列所构建的质粒并无上述生物学效应.结论 沉默K562细胞cyclin D1基因表达可达到有效的化疗增敏目的.     

PC12细胞SLC6A4基因沉默稳转细胞系的建立及SLC6A4基因沉默对缺氧PC12细胞凋亡的影响

目的 构建SLC6A4基因RNA干扰（RNAi）-短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,建立慢病毒介导沉默SLC6A4基因的PC12细胞稳转细胞系,检测SLC6A4基因沉默对缺氧诱导的细胞凋亡的影响。方法 设计合成3条针对SLC6A4基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,在293T细胞中共转染进行慢病毒包装。转染大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞,荧光显微镜观察GFP荧光,筛选最佳shRNA干扰序列,应用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR方法检测SLC6A4基因的表达,Western blot方法检测蛋白5-HTT的表达变化,流式细胞术检测沉默SLC6A4基因对缺氧诱导的PC12细胞凋亡的影响。结果 成功构建SLC6A4-shRNA慢病毒载体并转染PC12细胞,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞内SLC6A4基因和蛋白表达明显降低（P<0.01）,证实慢病毒载体能够有效沉默SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。结论 通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默PC12细胞SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。     

子宫中隔切除术后预防粘连方法探讨

目的 探讨子宫中隔并不孕患者宫腔镜术后不同处理方法预防宫腔粘连的效果.方法 55例子宫中隔并不孕患者行腹腔镜监护下宫腔镜子宫中隔切除术(TCRS),术后针对不同患者采用不同术后处理措施,包括宫腔放置与不放IUD,是否进行人工周期治疗,部分患者术后使用GnRH-a类药物治疗术后第1、3个月行宫腔镜检查随访,宫内放置IUD的患者;于术后第3个月取环.结果 54例患者术后进行宫腔镜检查随访,其中40例分别于术后第1、3个月完成了术后2次宫腔镜检查,另14例只完成一次检查.宫腔术后放环与否对术后宫腔形态影响无差异(P>0.05),术后使用人工周期治疗患者较未使用者子宫内膜厚,此两者术后第3个月宫腔镜检查发现宫底创面均已有内膜覆盖.使用GnRH-a类药物患者术后官腔形态满意.结论 TCRS术后宫腔放置IUD无助于预防术后粘连的发生;术后人工周期治疗应更个体化并有针对性的使用GnRH-a类药物治疗.术后及时进行宫腔镜检查随访可防止术后宫底新粘连的形成.     

复发性耳廓假性囊肿的治疗

目的 探讨不同方法对复发性假性耳廓囊肿的治疗效果.方法 对2008年5月至2012年2月在我科就诊的58例复发性假性耳廓囊肿分成2组,穿刺抽液+冷冻+加压包扎组(19例),手术切除囊肿前壁软骨+对穿缝合组(39例),随访3个月到1年,观察2组治愈率、复发率,有效率、并发症等情况.结果 对照组1次治愈后痊愈5例,复发14例,治愈率为26.3％,复发率为73.7％,有效率为78.9％,其中耳廓增厚6例,1例并发化脓性软骨膜炎.观察组治愈38例,复发1例,经过1次穿刺后治愈,治愈率为97.4％,复发率为2.6％,有效率为100.0％.所有患者无耳廓变形、增厚,无化脓性耳廓软骨膜炎的并发症.结论 囊肿前壁软骨切除+对穿缝合是治疗复发性假性耳廓囊肿的高效、首选办法,值得推广.     

10例狂犬病误诊原因分析

狂犬病近年来发病率有逐年增加的趋势,近十二年来,我们共遇见狂大病２３例,其中１０例被误诊为其它疾病,现就其误诊原因进行分析如下。１临床资料１．１ 一般资料：男８例,女２例;年龄最大７８岁,最小４岁。发病季节为３月～１１月。首诊科室,儿科３例、内科３例、转院３例、急诊科１例。１．２ 临床表现：发热７例,恐风５例,恐水６例,怕光３例,流涎１０例,胸闷、气促、呼吸困难４例,烦躁不安１０例,多汗７例,恐惧６例,肢体麻木４例,抽搐４例,恶心、呕吐２例,昏厥１例。所有病例发病至死亡时间为２天～６天,死亡原因为…     

欧洲药典适用性认证介绍

目的介绍欧洲药典适用性认证程序,为国内药品监管机构和原料药生产企业提供信息,促进我国原料药生产企业的国际化。方法通过查阅调研欧盟相关药品法规和与EDQM同行面对面的交流,详细了解欧洲药典适用性认证的组织机构和具体程序。结果与结论欧洲药典适用性认证程序在对原料药的质量控制有重要作用,加强了药典的监管力度,进一步保证了原料药的质量、安全性和有效性。     

新疆维吾尔自治区基层医院平均住院日调查分析

目的 通过对新疆维吾尔自治区14个县乡级医疗机构住院患者平均住院日及影响因素进行分析,为县乡级医疗机构进一步提高医疗管理质量提供依据.方法 将2009-2010年1504例县乡级医院住院患者平均住院天数,按性别、年龄、院别、付费方式、疾病分类进行描述性统计和秩和检验分析.结果 不同性别间及院别间平均住院日差异均有统计学意义(均P＜0.05),男性平均住院日为10.39 d,女性为8.69d,乡级医院为9.27d,县级医院为9.50 d.不同年龄间平均住院日差异有统计学意义(P＜0.05),小于15岁组、15 ～24岁组、25～44岁组、45 ～65岁组、大干65岁组平均住院日分别为8.10 d、7.66d、8.83 d、10.26 d和11.33 d.自费患者平均住院日为8.39 d,新农合组为9.10 d,商业保险组10.17 d,社会基本医疗保险患者则为11.08 d.不同疾病分类间平均住院日差异明显,妊娠类平均住院日最短,为6.73 d,而肿瘤患者则为14.26 d.结论 不同性别、不同年龄段、不同疾病分类及不同付费方式间平均住院日存在差异,县级医疗机构和乡级医疗机构住院患者平均住院日也存在差异.     

药品风险管理之风险的起因分析——关于药品天然风险

药品认知水平是把握药品天然风险的决定因素，却又受到伦理需求和产业发展需求的影响。药品不良反应监测，正是常规的取法三者平衡关系的制度工具。     

住院患者精神用药情况调查分析

目的：了解目前住院精神患者的药物使用情况。方法：采用一日法调查西安市精神卫生中心403例住院精神患者诊断和治疗情况，并与上海市精神卫生中心2004年调查结果相比较。结果：①传统精神药物使用显著减少，新型精神药物使用占据首位；②抗精神病药物使用趋向小剂量化；③本组联用丙戊酸盐类药物显著增多；④我院精神药物使用情况与上海精神卫生中心比较有显著差异。结论：近年来精神药物使用情况已发生了显著变化，与新型精神药物疗效好，副作用少，患者依从性高有关。     

不同方法治疗慢性宫颈炎的疗效分析

目的慢性宫颈炎是妇科最常见的疾病之一,可引起盆腔脏器炎症,并且与宫颈癌的发生关系密切。本文诣在探讨不同方法在慢性宫颈炎中的疗效。方法回顾性分析新乡市中心医院收治的210例宫颈炎患者,采用药物保妇康栓、聚焦超声治疗及宫腔镜下宫颈电切术的临床效果进行统计分析。结果宫颈电切术治疗有效率为97.9%,明显高于另外两组,差异有统计学意义。结论宫腔镜下宫颈电切术治愈慢性宫颈炎,并且切除宫颈移行带,减少宫颈癌发生。