2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况。方法:从NCBI基因库检索获得43株不同年代不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒与禽H5N1流感病毒NA基因的同源性达到85％,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守,但糖基化位点有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因可能来源于禽H5N1流感病毒;神经氨酸酶抑制剂治疗有效。     

广州市A型流感病毒血凝素基因的遗传变异研究

 【目的】 了解2006-2007年广州地区流感的病原学分布,掌握 H1N1亚型流感病毒血凝素基因(HA)的遗传和进化特征。【方法】 选取2006-2007年广州市19个流感监测点的流感病毒代表株共45株,应用病原学、血清学和分子生物学方法对病毒的型别进行了鉴定;选取24株H1N1亚型流感病毒进行全长HA基因的扩增、克隆与分子进化分析。 【结果】 A型流感病毒H1N1和B型流感病毒交替成为广州地区2006年流感的优势流行株;2006-2007年广州地区H1N1亚型流感病毒流行株在HA蛋白的抗原区、受体结合位点和潜在糖基化位点均发生了点突变;遗传进化分析结果表明,24株H1N1亚型毒株间基因同源性的平均值为98.4%;与WHO推荐的疫苗株(New Caledonia/20/1999和Solomon Islands/3/2006)相比,同源性高达96.6%和97.8%。【结论】 2006年,广州地区流感的病原体为H1N1亚型流感病毒和B型流感病毒;2006-2007年广州市H1N1亚型流感病毒HA基因发生了一定程度的变异, 有必要对毒株的变异加强监测;WHO推荐的2006-2007年H1N1亚型流感病毒疫苗株适用于我国人群的免疫预防。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)聚合酶PA、PB1和PB2编码基因的进化规律。方法:从NCBI流感病毒基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及人、猪和禽流感病毒相应的参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件比对和修剪此次流行株的代表序列及所有参考株序列并构建系统树,再比对和修剪此次流行株的代表序列及人A/H1N1病毒各年代(1918~2008年)参考序列并构建系统树,同时比对此次流行株的代表序列及人A/H1N1各年代(1918~2008年)参考序列编码PB2蛋白的氨基酸序列。结果:不同地区分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PB1和PB2编码基因均具有高度同源性,并聚集在一个独特的进化支上,与猪流感病毒对应基因接近。三者均与2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒基因(A/Iowa/CEID23/2005/H1N1)具有高度的相似性。2009年新型甲型H1N1流感病毒、2005年美国爱荷华州流行的H1N1 (DQ889682)病毒PB2蛋白第627位氨基酸与禽类流感病毒相同,均为谷氨酸,而与其他人A/H1N1 (1918~2008年)病毒的赖氨酸不同。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶基因可能来源于2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒全基因组序列重组分析

目的:分析2009年流行的新型甲型流感病毒（A/H1N1）全序列的基因重组现象。方法:从NCBI基因数据库下载2009年新型甲型流感病毒（A/H1N1）全基因组序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件对8条基因序列进行拼接和比对,分析2009年爆发株与历史流行株序列间的同源性;同时采用Simplot 3.5.1软件分析新型流感病毒A/H1N1基因重组现象。结果:2009年3月以来爆发的新型A/H1N1病毒株聚合酶B1(polymerase B1,PB1)基因来自于人H3N2,其同源性为93.7%;聚合酶B2 (polymerase B2,PB2)和聚合酶A (polymerase A,PA)与禽H5N1同源性较高,同源性分别为89.0%、89.9%;血凝素(hemagglutinin,HA)、核蛋白(nucleoprotein,NP)和非结构蛋白(non-structural protein,NS)与北美地区猪H1N1同源性较高,同源性分别为91.7%、93.1%和93.1%;神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和基质蛋白(matrix protein,MP)与欧洲地区猪H1N1同源性较高,同源性分别为90.5%、95.5%。全基因序列同源性分析发现2009年新型A/H1N1病毒与北美地区猪H1N1病毒同源性最高,为83.9%。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒可能是人H3N2、北美地区猪H1N1、欧洲地区猪H1N1、禽H5N1的基因重排病毒。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒非结构蛋白基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒的非结构蛋白(NS)基因进化规律。方法:从NCBI下载2009年新型甲型H1N1流感病毒以及北美、欧洲、亚洲地区以往流行的甲型H1N1流感病毒NS基因序列,利用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA 4.0)软件对所选序列进行基因进化分析,并用NJ法构建进化树;对2009年新型甲型H1N1流感病毒NS基因核苷酸序列同源性及编码蛋白氨基酸序列进行分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒NS基因来源于猪A/H1N1流感病毒,与2005~2007年猪A/H1N1流感病毒具有较高的同源性(97.5％~97.6％),与1930~2007年猪A/H1N1流感病毒具有明显的时间进化关系;其重要抗原及拮抗宿主抗病毒能力的氨基酸位点基本没有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒NS基因来源于猪A/H1N1流感病毒,NS基因编码蛋白拮抗宿主抗病毒能力并没有改变。     

福州市甲型H1N1流感病毒血凝素基因遗传特性研究

目的探究福州市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因的遗传变异特点及种系进化分布,为研究甲型H1N1流感病毒进化、致病性和流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞培养法和real-time PCR法进行流感病毒分离、鉴定。采用逆转录-聚合酶链反应扩增流感病毒血凝素基因,扩增产物经纯化后,进行血凝素基因HA区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后用DNASTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果福州市甲型H1N1流感病毒与参考株A/California/04/2009相比具有高度同源性,HA蛋白有4个位点氨基酸发生了替换,与猪流感代表株A/swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。福州市甲型H1N1流感病毒株都有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,分离株HA蛋白不具有多碱基裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与美国流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株共聚类为一个独立的小分支,进化关系最近,甲型H1N1流感病毒的HA源于古典型猪H1N1流感病毒,与A/swine/Iowa/1/1976(H1...     

新型甲型H_1N_1流感毒株NA基因特征和进化

目的 通过对新型甲型H1N1流感毒株神经氨酸酶(NA)基因序列的变异分析,揭示毒株NA基因变异与进化.方法 检测广东地区分离毒株NA基因核苷酸序列,同时对全球新型甲型H1N1流感毒株NA基因进行检索下载,采用Lasergene 7.1软件比对和分析NA基因核苷酸和氨基酸序列,结合临床资料分析变异基因进化,同时分析糖基化位点.结果 2009年4-12月69株毒株NA基因16个氨基酸位点置换,占3.41%(16/469);NA蛋白主要置换位点在V106I/H和N248D.毒株GD-801-2009(H1N1)和GD-1202-2009的NA基因明显受到的感染宿主选择性作用,而毒株GD-1-2009的NA基因明显受到的感染宿主负选择性作用.与毒株GD-1-2006(H5N1) NA基因比较,毒株GD-801-2009的NA基因插入Nt145-204,导致H1N1 NA蛋白增加第49~68位氨基酸(CNQSVITYENNTWVNQTYVN),其中包括4个糖基化位点.结论 广东新型甲型H1N1流感毒株NA基因正向不同方向进化;新型甲型H1N1流感NA蛋白新增4个糖基化位点.     

鼻咽癌中EB病毒启动子Qp的突变及其功能学研究

【目的】 探讨鼻咽癌细胞中启动EB病毒核抗原1(EBNA1蛋白)表达的EB病毒Q启动子(Qp)的变异特征,比较有第62 225位点(g→a)和第62 422位点(g→c)两个点突变的Qp与原型Qp(B95.8型)的功能学差异及其生物学意义&#65377;【方法】 采用PCR的方法扩增29例鼻咽癌组织石蜡标本和14例健康成人外周血标本(总共43例)中的Qp序列,PCR产物测序后分析其突变情况,统计学分析Qp中的点突变与鼻咽癌的相关性&#65377;把突变型和原型Qp分别克隆到荧光素酶报告基因载体上,检测相对光强度(RLU),比较突变型与原型Qp启动转录的活性&#65377;使用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验来比较突变型和原型Qp与Sp1蛋白的亲和力&#65377; 【结果】 通过PCR扩增和测序实验,证实Qp的突变与鼻咽癌有密切的相关性(P = 0.0395,< 0.05)&#65377;突变型Qp启动转录的活性明显高于原型(RLU之比约为2.5:1,P < 0.05),并且突变型Qp与Sp1的亲和力较原型Qp增强约1.52倍&#65377;【结论】 在鼻咽癌组织中,突变型Qp可能通过增强与Sp1亲和力的机制,使其启动转录的活性明显增强&#65377;Qp特定位点的突变在EB病毒对鼻咽上皮细胞的感染和转化过程中可能起了重要的作用&#65377;     

2013年南京市甲型H1N1流感病毒NA基因的进化分析

目的 :调查2013年南京地区新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的分子特征,了解NA基因的变异情况,分析NA基因进化特征。方法:提取18株新型H1N1流感病毒基因组RNA,RT-PCR扩增NA基因,测序并分析其遗传进化特征和重要功能位点。结果:2013年南京分离株与国内外推荐疫苗株NA基因高度同源,序列相似性达98.2%以上。18株分离株在进化树上分为2支,与国内疫苗株接近,与国际疫苗株存在一定的遗传距离;与国内外疫苗株相比,多个位点氨基酸发生变异;1株分离株的酶活性位点119位发生了变异;部分分离株糖基化位点也出现了增加和缺失的现象。结论:南京市2013年流行株与国内外疫苗株NA基因同源性仍然较高,疫苗依然有效。2013年后期的甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因累积了更多的变异,需加强监测。     

深圳地区新甲型H1N1（2009）流感病毒M基因特征分析

目的对深圳地区分离到的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因分子特性进行详细分析,并从分子水平上了解其对金刚烷胺类药物的耐药性。方法选取深圳地区分离培养到的55株新甲型H1N1（2009）流感病毒,对其M片段进行全长测序,采用DNAstar与MEGA3．1生物软件对M基因序列进行比对并用NJ法构建系统进化树。结果通过对M基因的氨基酸序列进行进化分析,发现深圳地区分离培养到的新甲型H1N1（2009）流感病毒更接近欧洲猪流感病毒,与季节性HINI流感病毒差异很大。经过序列分析发现,深圳株的M基因与A／California／07／2009高度同源,显示该病毒M基因较保守。此外,还发现所有深圳株的M2蛋白均出现s31N突变,显示对金刚烷胺类药物可能耐药。结论深圳流行的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因可能源于欧洲猪流感病毒,且均对金刚烷胺类药物有耐药倾向。应进一步加强对新甲型H1N1（2009）流感病毒的分子特征研究,并积极开展流感病毒耐药性监测。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒进化过程中猪作为宿主及“混合器”的作用

不同种属流感病毒通过基因重排产生变异病毒导致了多次周期性全球流感大流行。2009年爆发流行的新型甲型H1N1流感病毒是猪H1N1流感病毒、禽H5N1流感病毒和人H1N1流感病毒的基因重排病毒,其8条基因片段均有自己的进化特点。禽类流感病毒是导致人类流感流行的流感病毒的起源,其常在猪体内进行基因重排进化为人类流感病毒。猪是流感病毒的中间宿主,也是不同种属流感病毒基因重排的“混合器”,在2009年新型甲型H1N1流感病毒进化过程中起重要作用,是未来流感防制的重要环节。     

江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素和神经氨酸酶分子特征分析

目的:分析江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)变异情况,分析其遗传进化特征?方法:按照流感样病例定义,收集江苏省各哨点医院流感样病例标本,阳性样本经病毒分离培养及亚型鉴定?选取2013年不同时间段?不同地区具有代表性的14株甲型H1N1(09pdm)阳性毒株,利用特异性引物扩增HA?NA基因,测序并分析其遗传进化特征?结果:14株分离毒株与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%~98.4%和96.5%~98.0%?NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~98.9%和97.0%~98.5%?遗传进化分析表明,14株分离株HA和NA基因分属于不同的进化谱系?分子特征表现为HA氨基酸序列出现D114N?K300E?E516K的变异,NA分子特征表现为N44S位点变异?从2013年左右开始甲型H1N1(09pdm)流感基因多样性增加;通过FEL模型得到一个正向压力选择HA氨基酸位点310,一个正向压力选择NA氨基酸位点4,通过REL模型得到9个正向压力选择HA氨基酸位点179?180?239?301?303?310?311?312?313(含位点310),5个正向压力选择NA氨基酸位点4?23?52?287?374(含位点4)?HA蛋白具有9个潜在糖基化位点,7个位于HA1上,2个位于HA2上;NA蛋白共有9个潜在糖基化位点?14株分离毒株在NA蛋白酶活性中心及周围辅助位点上均未发现变异?结论:2013年江苏省甲型H1N1(09pdm)流感HA?NA基因变异加快,遗传多样性增加,未来的遗传进化值得进一步关注?     

2009H1N1流感病毒神经氨酸酶基因克隆与表达

目的制备2009H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)重组蛋白,为建立H1N1快速检测方法和神经氨酸酶抑制剂筛选模型奠定基础。方法采用MDCK细胞方法分离2009H1N1流感病毒,提取病毒RNA,RT-PCR生成NA基因,构建原核表达载体PET-102/D-TOPO-NA,IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳、WersternBlotting鉴定重组蛋白。结果成功分离2009H1N1流感病毒,NA蛋白119、152、275、292位氨基酸分别为Glu、Arg、His和Cys。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白分子相对分子质量约为64000,与预期一致。WesternBlotting证实该蛋白具有神经氨酸酶抗原活性。结论 IPTG诱导原核表达神经氨酸蛋白的最适浓度为0.1mmol/L。实验得到的蛋白尚需进一步纯化。     

一起学校甲型H1N1流感聚集疫情的流行特征和全基因组测序分析

目的 了解济宁市一起聚集流感疫情的甲型H1N1流感病毒全基因组特征,为甲型H1N1流感防控提供依据。方法 对在一起聚集流感疫情采集的12份患者咽拭子标本进行流感病毒实时荧光定量PCR法核酸检测,对阳性标本进行病毒培养和全基因组测序,利用DNASTAR软件分析核苷酸和氨基酸同源性,利用MEGA软件构建进化树,利用NetNGlyc、GPS-SUMO、NetPhos软件分别分析糖基化位点、类泛素蛋白修饰分子化位点和磷酸化位点。结果 12份咽拭子标本中,4份标本甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性,分离流感病毒株4株。同2018—2019年度北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018相比,8个基因节段核苷酸同源性范围为98.5%~99.8%;编码的10种蛋白氨基酸同源性范围为98.2%~100.0%。在进化树上,4株毒株位于两个进化簇,其中3株毒株位于同一进化簇,1株毒株位于不同进化簇。4株毒株编码的10种蛋白共发生50处氨基酸位点置换,血凝素蛋白抗原表位2个氨基酸位点发生置换,神经氨酸酶蛋白酶活性位点和神经氨酸酶抑制剂耐药位点均未发生变异,聚合酶酸性蛋白、聚合酶碱性蛋白1和聚合酶碱性蛋白2抑制剂耐药位点均未发生变异。结论 本次由甲型H1N1流感病毒引起学校流感聚集疫情有2个不同的源头,应加强对学校流感聚集疫情监测,加强学校流感防控。     

海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因特性

目的 分析海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化特征与关键氨基酸位点变异情况。 方法 从海南省流感监测网络实验室分离的流感毒株中按照不同时间选取16株H3N2亚型分离株进行一代全基因序列测定,应用DNA Star 7.0.1软件进行神经氨酸酶基因同源性分析,应用MEGA 10.8.1软件构建神经氨酸酶基因系统进化树,并分析耐药性位点与抗原决定位点氨基酸替换情况。 结果 神经氨酸酶基因同源性分析与系统进化分析显示,16株分离株与疫苗株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016（2018—2019）核苷酸与氨基酸相似性分别为98.5%~99.1%、98.3%~98.7%,进化上属于3c.2a1分支。14株分离株发生神经氨酸酶抗原性位点N329S变异,11株分离株发生E344K变异,未发生耐药性位点氨基酸替换。 结论 2019—2020年海南省流行的H3N2亚型流感病毒属于3c.2a1分支,与2018—2019年疫苗株亲缘关系较近;大部分分离株在神经氨酸酶抗原决定位点发生了一定的改变,但变异程度不大,未发生耐药位点变异。今后应持续加强流感病毒病原学监测,密切关注H3N2亚型流感病毒耐药性基因变异,及时跟踪关键氨基酸位点替换情况,为科学防控提供理论依据。     

2009年至2011年新甲型H1N1流感病毒HA基因同源性比较与进化分析

[目的]分析杭州市2009年1月至2011年1月新甲型H1N1流感病毒血凝素（HA）的基因序列,探讨该病毒的遗传变异和分子特性。[方法]应用RT-PCR的方法从临床标本中扩增新甲型H1N1流感病毒HA基因片段并测序。利用DNAMAN和Sequencher4.7软件对HA基因序列进行分析,比较HA基因氨基酸亲缘系数并绘制进化树。[结果]成功地对15例新甲型H1N1病毒的HA基因进行扩增并测序,2009年1月至2011年1月新甲型H1N1流感病毒的HA基因的氨基酸序列与参考株具有高度的同源性,其亲缘系数为98.9%~100%,且HA基因氨基酸序列发生了一定的变异。[结论]2009年至2011年新甲型H1N1流感病毒的基因组HA序列与我国和其他国家的新甲型H1N1流感病毒具有高度的同源性,但HA基因的氨基酸序列发生了变异,可能与患者的病情有关,因此需密切关注新甲型H1N1流感病毒的流行情况。