人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１ｂ申，在大肠杆菌一成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导异位化骨的趋势。     

重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体, 研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ 重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２ （ＢＭＰ－２） 成熟肽的０．３６ ｋｂ 基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７ （ＢＭＰ－７） 成熟肽的０．４４ｋｂ 基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７ 融合基因; 经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。克隆质粒转化的工程菌,经４２℃诱导４～６ ｈ 后,高效表达重组人骨形态发生蛋白－２／７, 在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一新的蛋白带, 分子量约２９ ｋｕ,约占菌体总蛋白的２０％ ,表达蛋白以包涵体的形式存在,经初步纯化、裂解、复性后的ＢＭＰ－２／７ 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。ＢＭＰ－２／７ 融合基因的构建和表达,可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白     

重组人骨形态发生蛋白—2／7融合基因的构建及其在大肠杆菌 …

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体,研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的０．３６ｋｂ基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７（ＢＭＰ－７）成熟肽的０．４４ｋｂ基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７融合基因;经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,温度诱导表达,表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小     

人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１６ｂ中，在大肠杆菌中成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导导位体骨的趋势。     

人骨形成蛋白2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定

利用基因工程技术生产人骨形成蛋白（ｈＢＭＰ），为其诱骨机理及临床应用研究提供前提条件。作将ｈＢＭＰ２ ｃＤＮＡ３’端７３２ｂｐ片段，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，经ＩＰＴＧ诱导后，表达产物存在于包涵体中，将其纯化复性后，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＦＰＬＣ分析，并作小鼠体内异位诱骨活性检测。表达的ｈＢＭＰ２与ＧＳＴ的融合蛋白Ｍｒ＝５１ｋｕ，占菌体总蛋白的３０％，纯化、复性后，ＦＰＬＣ分析示尖而     

人钙调素基因Ⅲ表达载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃＤＮＡ），将其插入表达载体ｐＢＶ２００，构建重组表达质粒ｈＣａＭⅢ／ｐＢＶ２００，用酶切、ＤＮＡ测序、ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。用ＣａＣｌ２法转化大肠杆菌ＤＨ５α使其表达ＣａＭ蛋白。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白，经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可观察到一分子量与理论值相符（约１７０００）的诱导表达条带，其表达量占菌体蛋白总量的２０％。进一步分析表达产物的性质表明，ＣａＭ主要以可溶性形式表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果证实，１７０００的表达条带可与标准鼠抗ＣａＭＭｃＡｂ起特异反应。结论：重组人ＣａＭ在大肠杆菌中的成功表达，为进一步研究ＣａＭ的生物学功能及研制抗ＣａＭ单克隆抗体奠定了基础     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

重组人骨形态发生蛋白诱导异位成骨的病理学观察

目的：本文报告了重组人骨形态发生蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２）在小鼠肌肉内诱导异位成骨的生物学作用，方法：将大肠杆功表达的ｒｈＢＭＰ－２成熟肽植入小鼠股部肌肉。结果：植入ｒｈＢＭＰ－２后ｄ１就有间充质细胞向植入区内聚集；ｄ５出现典型的软骨细胞；ｄ７钙化开始；ｄ１０形成雏形的骨髓腔，ｄ１４骨髓腔内出现幼稚的造血细胞；２１ｄ－３０ｄ形成大量网状骨小梁、骨单位、在骨小梁间隙出现骨髓细胞。结论：大肠杆菌中表达     

人重组骨形态发生蛋白—2和β转化生长因子在诱导成骨中的 …

对人重组骨形态发生蛋白－２和β转化生长因子在诱导成骨的协同作用进行探讨。方法：２１０只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠随机分为３组,每组７０只,试验侧均位于右后肢,设立ｒｈＢＭＰ－２／牛松质骨载体,单纯牛松质骨载体为对照组,分别于术后１２ｈ－２１ｄ共１１个时间占才,观察其诱导成骨过程。结果ｒｈＢＭＰ－２／ＴＧＦ－β／牛松质骨载体组在诱导间充质细胞增殖,分化,软骨细胞及新生骨形成方面均早于ｒｈＢＭＰ－２牛松质骨载体     

重组人骨形态发生蛋白—2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2)，方法：hBMP-2原核表达载体pYR(pBV220-hBMP-2)转化E.coli BL21,SDS-PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析DEAE和分子筛S－300纯化重组蛋白，自然缓降复性法对其复性。结果：SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带，而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时，其表达效率较高，在此状态下，温度诱导表达4h，目的蛋白表达量最高，以后随着时间的延长，表达量销下降，重组蛋白经纯化后植入小鼠肌肉，组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生以及软骨与骨形成，结论：重组hBMP-2具有良好异位成骨活性。     

重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)。方法hBMP－2原核表达载体pYR(pBV220－hBMP-2)转化 E coli BL21,SDS－PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析 DEAE和分子筛 S－300纯化重组蛋白,自然缓降复性法对其复性。结果SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带,而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时,其表达效率较高;在此状态下,温度诱导衣达4h,目的蛋白表达量最高,以后随着时间的延长,表达量稍下降。重组蛋白经纯化后植人小鼠肌肉,组织学观察到肌肉内大量间允质细胞增生以及软骨与骨形成。结论重组hBMP－2具有良好异位成骨活性。     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

人骨形态发生蛋白-2基因腺病毒载体异位成骨

目的：评价人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因腺病毒表达载体(recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene, AdBMP-2)成骨能力并探讨其成骨机制。方法：应用 AdBMP-2体外感染兔骨髓间质干细胞（BMSC），7 d后观察hBMP-2和碱性磷酸酶(ALP)的表达,21 d后观察感染细胞钙结节形成能力。同时将AdBMP-2行裸鼠腓 肠肌组织内注射，术后20 d取材，观察hBMP-2的表达及肌组织内异位成骨情况。结果：AdBMP-2可高效感 染BMSC并获得hBMP-2的有效表达，ALP表达增高并形成钙结节。AdBMP-2在体内同样表达hBMP-2， 并且以软骨化骨的方式启动成骨。结论：感染AdBMP-2的BMSC向成骨细胞分化，AdBMP-2在体内有着良好的成骨能力。     

hBMP-2基因转染的MSC与藻酸钙凝胶的生物相容性研究

目的探讨人类骨形态发生蛋白-2（human bone morphogenetic protein-2，hBMP-2）基因转染的兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells.MSC）与藻酸钙凝胶的生物相容性，为骨组织工程中生物材料的选择提供依据。方法应用脂质体介导的方法将真核表达载体pCDNA3介导的质粒pCDNA3-hBMP-2导入体外培养的兔MSC中，免疫组织化学和RT-PCR检测转染后hBMP-2基因的表达；将G418筛选获得的阳性克隆继续扩增培养，与藻酸钙凝胶复合作为实验组，单纯转染的细胞为对照组，在不同的时间行扫描电镜、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、碱性磷酸酶（ALP）、台盼蓝染色检查。结果免疫组织化学和RT-PCR均证实基因转染成功，4周时仍有表达；转染的MSC与藻酸钙复合良好，并能在其中保持活性，活力未受影响。结论hBMP-2基因转染的MSC能够获得瞬时及稳定表达，是一种新型的种子细胞；其与藻酸钙凝胶复合用于骨缺损的修复具有较强的可行性。     

人骨形成蛋白-2基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的：克隆人骨形成蛋白-2（BMP-2）基因cDNA，构建含BMP-2基因的重组腺病毒载体。方法：采用RT-PCR方法克隆BMP-2基因cDNA，并插入克隆载体pGEM-T中进行全序列分析。将BMP-2基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，构建pShuttle-BMP2重组质粒，再将其中的表达盒克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA-pAd-BMP。 结果：成功地克隆长约1 200 bp的BMP-2 cDNA，并成功地构建其腺病毒载体，经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞，包装、扩增后得到人骨形成蛋白-2重组腺病毒，其滴度约为1×10¹¹nfu•L^-1，该滴度可满足进一步的BMP-2成骨作用的研究。结论:成功地构建BMP-2腺病毒载体。     

hBMP2转基因载体的构建及其在兔骨髓基质细胞中的表达

腹泻是离乳婴猴常见病,死亡率极高的病。作者多年的统计结果表明,死亡婴猴中58．3％死于腹泻。过去腹泻早期也使用过一些药物进行治疗, 但效果不太理想。最近,作者用胃肠粘膜保护剂联合思密达,口服补液盐辅助治疗婴猴腹泻,取得良好效果。 1 材料与方法 1．1 动物的选择选取离乳后3-60 d(4月龄离乳)的腹泻婴猴作试验观察,发病时间不超过24 h。全部婴猴半屏     

hBMP-7基因重组腺相关病毒载体的构建及人牙髓细胞转染的研究

目的:构建人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因重组腺相关病毒载体,并转染牙髓细胞,为牙组织损伤修复的基因治疗做探索性研究。方法:以含hBMP-7全长cDNA的载体PTcDNA-hBMP-7为模板进行PCR扩增,将回收产物和pAAVIRES-hrGFP分别双酶切后连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP-7。采用磷酸钙共沉淀法转染293细胞进行病毒包装,收获的病毒液按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀、酚:氯仿反复抽提法浓缩纯化,斑点杂交法测病毒滴度,并转染体外培养的牙髓细胞。结果:酶切鉴定和测序结果表明,hBMP-7基因成功克隆入pAAVIRES-hrGFP载体中。在293细胞中包装出重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,物理滴度为3.0×1011v.g/ml。rAAV转染牙髓细胞后GFP表达逐渐增强,可持续表达到4周以后。结论:重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,能有效转染牙髓细胞表达目的基因。可用于牙组织工程基因治疗的研究。