药对防风-乌梅对肥大细胞分泌Th2类细胞因子的作用及机制研究

目的:药对防风-乌梅抑制肥大细胞系P815细胞分泌Th2类细胞因子的作用及机制,为该药对临床应用提供科学依据。方法:胰蛋白酶刺激P815细胞方法建立肥大细胞脱颗粒模型,用ELISA法观察药对防风-乌梅对肥大细胞分泌Th2类细胞因子IL-4、IL-13及相关信号通路蛋白Akt、ERK的影响。结果:药对防风-乌梅在体外可阻断肥大细胞IL-4的分泌,并抑制信号通路蛋白Akt、ERK的表达,与细胞模型组比较有统计学差异(P0.05或P0.01)。结论:药对防风-乌梅抗哮喘机制可能与该药对通过抑制肥大细胞ERK和AKT蛋白,阻断肥大细胞分泌IL-4有关。     

IL-29促进肥大细胞Th2细胞因子释放的信号转导机制

目的:检测白细胞介素(IL)-29对肥大细胞Th2细胞因子分泌的影响和可能的信号转导通路.方法:肥大细胞P815培养、激发后收集不同时间点的细胞和上清液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中IL-4和IL-13的水平,用细胞激发信号ELISA(CASE)方法检测丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、细胞外信号调节激酶(ERK)、信号转导子和转录激活子(STAT)3和p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路蛋白磷酸化情况.结果:IL-29能够促进肥大细胞P815分泌IL-4和IL-13.AG490和LY294002阻断IL-29引起的肥大细胞IL-4分泌并抑制IL-29引起的STAT3和Akt磷酸化.LY294002阻断IL-29引起的肥大细胞IL-13分泌并抑制IL-29引起的Akt磷酸化.结论:IL-29刺激肥大细胞P815分泌IL-4可能是通过激活Akt和STAT3信号转导通路实现的,而IL-29刺激肥大细胞P815分泌IL-13可能与Akt信号转导通路激活有关.     

TNF-α对肥大细胞IL-10、IL-12分泌和组胺释放的影响

目的:检测TNF-α对P815肥大细胞IL-10,IL-12分泌和组胺释放的影响。方法:P815肥大细胞培养后,用不同浓度的TNF-α单独或联合用TNF-α单克隆抗体激发肥大细胞,不同时间点收集上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IL-10,IL-12和组胺水平。结果:单独作用时,TNF-α促进P815肥大细胞IL-12分泌,而对IL-10分泌和组胺释放无明显影响,TNF-α单克隆抗体的应用可以阻断TNF-α引起的肥大细胞IL-12分泌。结论:TNF-α可以通过促进肥大细胞分泌IL-12参与肥大细胞相关的炎症过程。     

尘螨抗原对P815肥大细胞维生素D受体和炎症介质分泌的影响及1,25（OH）2D3的免疫调节作用

目的探讨1,25（OH）2D3对尘螨抗原（Derp）直接作用的P815肥大细胞维生素D受体（VDR）表达及IL-4、IL-10分泌的影响及其免疫调节作用。方法用不同浓度Derp、1,25（OH）2D3单独或联合作用P815细胞,收集细胞和上清液。采用Westernblot、RT-PCR法分别检测P815肥大细胞VDR蛋白及mRNA表达,ELISA法检测细胞悬液上清液中IL-4、IL-10浓度。结果P815肥大细胞表达VDR。不同浓度Derp对P815肥大细胞VDR表达有调节作用,作用12、24h组VDRmRNA表达呈明显浓度依赖性下调（P＜0.05）。不同浓度Derp作用P815肥大细胞36h后,VDR蛋白表达呈浓度依赖性下调。高浓度1,25（OH）2D3单独作用对VDR表达有上调作用（P＜0.05）。不同浓度1,25（OH）2D3单独作用P815肥大细胞可促进IL-10的释放（P＜0.05）,但对P815肥大细胞IL-4分泌无明显影响（P＞0.05）。1,25（OH）2D3可抑制Derp引起的IL-4分泌（P＜0.05）,且1,25（OH）2D3浓度越高,抑制作用越强。Derp、1,25（OH）2D3联合处理P815肥大细胞36h后,上清液中IL-10浓度无明显变化（P＞0.05）。结论1,25（OH）2D3可通过上调肥大细胞上VDR表达,促进IL-10分泌,从而发挥抗炎作用。1,25（OH）2D3对Derp引起的肥大细胞免疫反应的干预作用可能是通过抑制IL-4的合成和分泌,从而抑制Th2型免疫应答的。     

TNF-α对凝血酶引起的肥大细胞蛋白酶激活受体表达的影响

目的:探讨TNF-α对凝血酶引起的P815肥大细胞上蛋白酶激活受体表达的影响。方法:用或不用TNF-α预处理肥大细胞后,以不同浓度凝血酶激发P815肥大细胞,用流式细胞术检测肥大细胞上PAR-1,2,3,4表达的变化情况。结果:TNF-α不影响凝血酶作用肥大细胞P815后PAR-1表达;TNF-α预处理后凝血酶作用肥大细胞P815后,PAR-2,3,4表达较基础培养液对照组和非TNF-α处理组增强。结论:促炎因子TNF-α能够调节凝血酶引起的肥大细胞PAR表达进而参与肥大细胞相关的炎症反应。     

胰蛋白酶诱导人脐静脉内皮细胞分泌内皮素-1

目的：探讨胰蛋白酶对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分泌内皮素（ET）-1的影响。方法：分离、培养HUVECs,细胞免疫荧光技术检测内皮细胞表达蛋白酶活化受体（PAR）-2。内皮细胞生长添加物和肝素培养体系培养HUVECs,激活剂为胰蛋白酶和丝-亮-异亮-甘-赖-缬（SLIGKV-NH2）,ELISA检测细胞上清中ET-1水平。结果：FITC标记的抗人PAR-2抗体染色细胞的荧光主要存在于细胞周边及突起处,说明HUVECs表达PAR-2。随着胰蛋白酶和SLIGKV-NH2浓度升高（与单纯细胞培养液比,P〈0.05）,HUVECs分泌ET-1的水平也相应升高。两种刺激剂诱导的ET-1水平正相关。α1-抗胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂和PAR-2抑制肽显著抑制胰蛋白酶或SLIGKV-NH2诱导的ET-1释放。结论：胰蛋白酶很可能通过PAR-2促进内皮细胞分泌ET-1。     

肥大细胞激活及组织胺水平测定

目的　建立肥大细胞激活及组织胺测量的实验研究系统。方法　将手术切除的人类肺、皮肤、扁桃体及关节滑膜组织剪碎后 ,在 37℃条件下用 型胶原酶和 型透明质酸酶进行消化。经洗净及肥大细胞计数后 ,悬浮的细胞被均匀地加入含刺激剂、抑制剂或缓冲液的试管中 ,并在 37℃条件下培养 15分钟 ,用冷 HBSS缓冲液及离心方法终止上述反应 ,取上清液置 - 37℃下保存。用与组织胺特异结合的玻璃纤维为基础的荧光显色法测量组织胺。结果　肺、皮肤、扁桃体和关节滑膜组织的肥大细胞分别占相应组织悬浮细胞总数的 4 %、5 %、0 .5 %和4 %左右。各组织中肥大细胞自发性组织胺释放量均占其组织胺总量的 9%以内。绵羊抗人 Ig E和钙离子载体的最佳浓度分别是 1%和 1μmol/ L,其分别能引起高达 19%和 5 6 %的肥大细胞组织胺释放。肥大细胞类胰蛋白酶抑制剂亮肽素 (亮肽素 )能抑制 Ig E依赖性肺及扁桃体肥大细胞的激活。结论　酶消化法分离肥大细胞为肥大细胞激发试验提供了快速、重复性好的试验基础。以玻璃纤维特异性结合组织胺为基础的组织胺测量方法重复性好、样品用量小 ,节省人力及财力。绵羊抗人 Ig E和钙离子载体均为肥大细胞的有效激活剂。亮肽素能抑制 Ig E依赖性肥大细胞的激活     

肥大细胞激活及组织胺水平测定

目的：建立肥大细胞激活及组织胺测量的实验研究系统。方法：将手术切除的人类肺、皮肤、扁桃体及关节滑膜组织剪碎后，在37℃条件下用I型胶原酶和I型透明质酸酶进行消化。经洗净及肥大细胞计数后，悬浮的细胞被均匀地加入含刺激剂、抑制剂或缓冲液的试管中，并在37℃条件下培养15分钟，用冷HBSS缓冲液及离心方法终止上述反应，取上清液置－37℃下保存。用与组织胺特异结合的玻璃纤维为基础的荧光显色法测量组织胺。结果：肺、皮肤、扁桃体和关节滑膜组织的肥大细胞分别占相应组织悬浮细胞总数的4％、5％、0．5％和4％左右。各组织中肥大细胞自发性组织胺释放量均占其组织胺总量的9％以内。绵羊抗人IgE和钙离子载体的最佳浓度分别是1％和1μmol/L，其分别能引起高达19％和56％的肥大细胞组织胺释放。肥大细胞类胰蛋白酶抑制剂亮肽素（亮肽素）能抑制IgE依赖性肺及扁桃体肥大细胞的激活。结论：酶消化法分离肥大细胞为肥大细胞激发试验提供了快速、重复性好的试验基础。以玻璃纤维特异性结合组织胺为基础的组织胺测量方法重复性好、样品用量小，节省人力及财力。绵羊抗人IgE和钙离子载体均为肥大细胞的有效激活剂。亮肽素能抑制IgE依赖性肥大细胞的激活。     

8名新生儿α_1-抗胰蛋白酶等位基因频率分布调查

α_1~=抗胰蛋白酶(α_-AT)能抑制胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶以及某些细菌产生的蛋白酶等多种蛋白水解酶,是体内主要的蛋白酶抑制剂。     

IL-12刺激肥大细胞IL-13分泌与ERK信号转导通路的关系

目的: 检测IL-12对肥大细胞介质分泌的影响并探讨其可能的信号转导通路。方法：小鼠肥大细胞P815培养后,用不同浓度IL-12激发后收集细胞和上清,上清用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测组胺、IL-6和IL-13的分泌量,P815细胞用细胞激发信号ELISA（CASE）方法检测信号转导通路蛋白ERK和P38磷酸化情况。 结果： 不同浓度IL-12(0、1.0、10.0 和100.0 μg•L^-1)激发后,P815细胞IL-13分泌量较基础分泌量均增加,并且随IL-12浓度增加而增加;而P815细胞IL-6和组胺释放量与基础分泌量比较差异均无显著性。ERK信号转导通路抑制剂PD98059、U0126预处理的经不同浓度IL-12激发P815细胞后,细胞内ERK磷酸化百分比较未加抑制剂组均显著降低（P<0.05）;且P815细胞IL-13分泌量较未加抑制剂组亦显著降低（P<0.05）。P38信号转导通路抑制剂SB203580预处理的不同浓度IL-12激发P815细胞后,细胞内P38磷酸化百分比与未加抑制剂组比较差异均无显著性;且P815细胞IL-13分泌量与未加抑制剂组比较差异均无显著性。结论：IL-12刺激肥大细胞P815分泌IL-13可能是通过激活ERK信号转导通路实现的。     

IL-29调节的肥大细胞膜表面和胞浆内蛋白酶激活受体表达分析

目的:检测白细胞介素(interleukin,IL)-29引起的肥大细胞膜表面和胞浆内蛋白酶激活受体(protease activated receptor ,PAR)-1,2,3,4表达?方法:肥大细胞P815培养后以不同浓度的IL-29激发肥大细胞,在不同时间点收集细胞,给予透膜和非透膜处理后用流式细胞术检测肥大细胞膜表面和胞浆内蛋白酶激活受体的表达?结果:IL-29激发肥大细胞2?6和16 h后肥大细胞膜表面和胞浆内PAR-1表达与相应对照相比差异有统计学意义,而IL-29调节的膜表面PAR-1表达与胞浆内PAR-1表达相比,差异无统计学意义?IL-29引起的肥大细胞膜表面和胞浆内PAR-2,3,4表达与相应对照相比,差异无统计学意义;而IL-29激发2 h肥大细胞膜表面PAR-2表达与胞浆内PAR-2表达相比,差异有统计学意义;IL-29激发6 h肥大细胞膜表面PAR-3表达与胞浆内PAR-3表达相比,差异有统计学意义;IL-29激发2?6和16h后肥大细胞膜表面PAR-4表达与胞浆内PAR-4表达相比,差异有统计学意义?结论:IL-29可以下调P815肥大细胞膜表面和胞浆内PAR-1表达,且IL-29引起的膜表面和胞浆内PAR-1表达无差异;尽管检测到PAR-2,3,4在膜表面和胞浆内的表达情况不同,但IL-29对膜表面和胞浆内PAR-2,3,4表达的调节作用不明显;流式细胞术检测的膜表面和胞浆内PARs表达结果均可反应IL-29调节的P815肥大细胞PARs表达情况?     

IL-17在哮喘小鼠模型中表达及其对肥大细胞IL-6分泌的影响

目的 :研究白细胞介素(interleukin,IL)-17在哮喘小鼠模型中的表达,观察其对肥大细胞IL-6分泌的影响。方法:BALB/c小鼠随机分为对照组和哮喘组,分别用等量磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)干预,检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞(eosnophils,EOS)数验证模型的成功建立。应用逆转录-聚合酶链反应法、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测两组小鼠肺组织中IL-17m RNA、BALF及血清中IL-17的表达差异。细胞实验分为对照组和IL-17组,分别予等量培养基和IL-17干预小鼠肥大细胞株(P815)后收集上清,用ELISA检测IL-6的水平。结果 :哮喘组BALF中细胞总数及EOS计数较对照组显著升高(P<0.05),模型建立成功。哮喘组肺组织中IL-17 m RNA、BALF及血清中IL-17表达较正常组显著升高(P<0.05)。细胞水平的研究发现IL-17组P815上清中IL-6表达较正常组显著升高(P<0.05)。结论 :IL-17在OVA诱导哮喘小鼠模型中表达升高。IL-17刺激肥大细胞分泌IL-6,可能在哮喘的发病中起促进作用。     

哮喘小鼠模型中IL-25表达及其对肥大细胞IL-6分泌的影响

目的:探讨哮喘小鼠模型中白细胞介素(interleukin,IL)-25的表达,研究其对肥大细胞IL-6分泌的影响?方法:6~8周龄BALB/c小鼠随机分为对照组和哮喘组,分别用等量磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)或卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏,检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞总数及嗜酸性粒细胞(eosnophils,EOS)计数验证模型的成功建立?两组小鼠肺组织中IL-25 mRNA?BALF及血清中IL-25的表达分别应用逆转录-聚合酶链反应法?酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测?小鼠肥大细胞P815分为对照组和IL-25组,分别予等量培养基和IL-25干预,收集细胞培养上清,用ELISA检测IL-6的水平?结果:哮喘组BALF中细胞总数及EOS计数较对照组显著升高(P < 0.01),小鼠出现呼吸频率加快?烦躁不安等表现,模型建立成功?哮喘组肺组织中IL-25 mRNA?BALF及血清中IL-25表达较正常组显著升高(P < 0.01)?细胞水平的研究发现IL-25组P815上清中IL-6表达较对照组显著升高(P < 0.01)?结论:IL-25在OVA诱导哮喘小鼠模型中表达升高?IL-25刺激肥大细胞分泌IL-6,可能在哮喘的发病中起促进作用?     

RANTES调节P815细胞膜与细胞质中蛋白酶激活受体表达的分析

目的:研究趋化因子RANTES对肥大细胞膜表面与细胞质内蛋白酶激活受体(protease-activated receptors,PARs)各亚型表达的影响?方法:肥大细胞瘤细胞P815以不同浓度RANTES(0.1?1.0?10.0?100.0 ng/ml)激发,于不同时间点(2?6及16 h)收集细胞,予透膜及非透膜处理,流式细胞术检测全细胞与细胞膜PARs的表达水平,分析细胞膜与胞质中PARs的表达变化?结果:RANTES作用6 h可显著下调细胞膜表面PAR1,2 h及16 h有下调趋势但差异无统计学意义,该下调效应可被抗RANTES单克隆抗体(anti-RANTES)取消;透膜处理后分析结果显示,RANTES对细胞质内PAR1表达无显著调节作用,细胞膜与细胞质中PAR1表达差异无统计学意义?RANTES对P815细胞PAR2?PAR3?PAR4表达均无显著调节作用?结论:RANTES可选择性调节肥大细胞膜表面PAR1表达水平,对细胞质内PAR1及其他PARs亚型(PAR2?PAR3?PAR4)胞膜与胞质水平均无显著影响?     

腹泻型肠易激综合征患者结肠肥大细胞与症状相关性研究

目的 探讨腹泻型肠易激综合征（D-IBS）患者结肠黏膜中肥大细胞与症状的相关性. 方法 通过免疫荧光法检测肥大细胞在结肠黏膜的分布与计数,酶联免疫实验（ELISA）检测类胰蛋白酶的含量,通过Spearman相关性分析检验肥大细胞计数与症状的相关性. 结果 肥大细胞主要分布于结肠黏膜固有层腺体之间.D-IBS患者肠黏膜肥大细胞明显高于健康对照组（P＜0.05）,肥大细胞计数与腹痛严重程度相关（r =0.35,P＜0.05）.D-IBS患者结肠黏膜类胰蛋白酶含量高于健康对照组（P＜0.01）. 结论 D-IBS患者结肠黏膜中的肥大细胞数目增多与腹痛程度有关,可能是因为肥大细胞活化后类胰蛋白酶等产物释放增加调节内脏感知.     

Up regulation of interleukin-8 expressions induced by mast cell tryptase via protease activated receptor-2 in endothelial cell line

Treyxpctlausseiv,ely a in s merainste ce pllro tgeraasneule so,cc uisrri rnegpor taeldmo tsotstimulate microvascular leakage potently and to augmentthe process in allergic inflammatory responses·1Tryptase also activates endothelial cells by inducinghuman dermal microvascular endothelial cell tubeformation2 and up-regulating the pro-inflammatoryfactors in human umbilical endothelial cells·3In humanperipheral blood eosinophils, tryptase inducesinterleukin-6 ( IL-6 ) and interleukin-8 ( IL-8 )…     

蛋白酶激活受体-2激动剂对人皮肤和扁桃体肥大细胞释放组胺和类胰蛋白酶的影响

目的:研究蛋白酶激活受体-2(PAR-2)激动剂对人皮肤和扁桃体肥大细胞释放组胺和类胰蛋白酶的影响.方法:用PAR-2激动剂激发经酶悬浮的人皮肤和扁桃体肥大细胞,并分别测量类胰蛋白酶和组胺的释放量.结果:PAR-2激动剂丝-亮-异亮-甘-赖-缬(SLIGKV)可引起皮肤肥大细胞组胺释放,但对类胰蛋白酶释放无影响.相反,SLIGKV可引起扁桃体肥大细胞的类胰蛋白酶,而不是组胺释放.另外一种PAR-2激动剂反肉桂酰-亮-异亮-甘-精-亮-鸟-[酰胺](te-LIG-RLO-NH2)比SLIGKV-NH2诱导类胰蛋白酶和组胺释放的作用弱.结论:我们首次报道了皮肤和扁桃体肥大细胞具有在体外释放类胰蛋白酶的特性.皮肤和扁桃体肥大细胞释放类胰蛋白酶和组胺的差别揭示了一种新的肥大细胞对刺激产生反应的异质性的类型,提示人类肥大细胞至少有2种脱颗粒信号的自我放大机制.