Livin和Survivin基因联合靶向siRNA重组表达载体的构建和鉴定

目的 构建Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体,探讨用RNA干扰方法同时下调Livin和Survivin基因表达的增效作用.方法 通过前期的实验,分别从靶向Livin基因和Survivin基因的siRNA序列中各挑选出1对最有效的siRNA序列,然后采用1个载体编码2个shRNA技术,将其构建到同一个真核表达载体上,转化DH5a菌株,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析.结果 经酶切鉴定和测序分析证实Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功.结论 Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功.     

针对DEK原癌基因的siRNA真核表达载体的构建

目的 以DEK基因为靶基因,针对其特定核苷酸序列,构建psiRNA-hHDEK表达载体,转染宫颈癌CaSki细胞,观察DEK siRNA对DEK基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的靶向沉默效应.方法 根据DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiR-NA-hHlneo中,构建能在真核细胞中表达的靶向DEK基因的siRNA重组质粒;应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western Blot检测转染后DEK mRNA和蛋白表达.结果 筛选出阳性克隆,抽提质粒,经限制性内切酶AseI酶切鉴定及测序分析证实合成的siRNA序列正确,并已准确克隆入psiRNA-hHl neo我体中.DEK特异性siRNA栽体构建成功.经RT-PCK和Western Blot测定分析,转染质粒psiRNA-hHDEK CaSki细胞组DEK mRNA和蛋白的表达明显减少.结论 成功构建了DEK特异性siRNA表达载体.设计构建的真核表达载体可以特异性干扰DEK原癌基因的表达,为进一步研究DEK基因的功能奠定了基础.     

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向Survivin基因及CDKl基因的短发夹样RNA（Short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDKl序列,遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDKl基因的shRNA寡核苷酸序列,构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒,并进行限制性内切酶酶切及基因测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析,pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pu6-shRNA-CDK1重组质粒及pu6-shR-NA-Survivin-U6-shRNA—CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。结论成功构建Survivin基因及CDKl基因联合靶向shRNA重组质粒,为进一步研究Survivin基因和CDKl基因联合干扰提供了新的方法。     

siRNA抑制肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的研究

目的 研究siRNA对肝癌细胞株HepC2中Survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成一对Survivin编码基因的反向重复序列，中间间隔9个核苷酸序列，通过定向克隆至载体Psilencer2．1，构建siRNA真核表达载体，经稳定转染HepG2细胞后应用RT-PCR及流式细胞术检测肝癌细胞中Survivin基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况。结果 测序证实siRNA真核表达载体构建成功。通过RT-PCR及流式细胞术检测，siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制Survivin基因表达分别达73％和75％。结论 构建的：Psilencer( )-Survivin重组质粒能有效抑制Survivin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达。为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

磷脂酰肌醇激酶-3小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建和鉴定靶向磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K） 亚单位编码基因PI3Kcb （catalytic,beta polypeptide）基因的小干扰RNA真核表达载体.方法：根据siRNA设计原则,在PI3Kcb mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体pDC316-EGFP-U6,重组后获得siRNA载体质粒pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,采用PCR检测和DNA测序以保证siRNA的方向和序列正确.结果：得到阳性重组克隆pDC316-PI3Kcb siRNA,经过PCR鉴定和测序,结果正确.结论：成功构建靶向PI3Kcb基因的siRNA载体pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,为PI3Kcb的基因沉默研究奠定了可靠的基础.     

STAT3基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列,聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架,克隆至载体psi Lent GeneTM中构建重组体,转化E.coli DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体,为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。     

靶向克隆法构建pET15b-VP3原核表达载体

目的探索利用PCR产物靶向克隆法构建能够表达凋亡素的pET15b-VP3原核表达载体。方法以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板,PCR扩增VP3基因的366bp片段,应用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性pET15b,得到重组表达载体pET15b-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切,图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体。结果 PCR产物经过电泳鉴定可见366bp特征性的VP3片段,重组质粒经双酶切电泳获得了一个大小为366bp的VP3片段,重组质粒测序证实VP3cDNA编码区成功地插入了pET15b,且其序列与GeneBank中VP3cDNA序列完全一致。结论靶向克隆法可快速,高效地构建pET15b-VP3原核表达载体,为进一步研究VP3药用价值奠定了基础。     

靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向survivin基因的siRNA的表达载体,研究survivin在喉癌中的作用机制。方法根据基因库上sur-vivin cDNA序列,设计合成靶基因序列,将其寡核苷酸退火后插入到Pgenesil-1表达载体中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。结果酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向survivin基因表达的siR-NA干扰质粒载体Pgenesil/survivin,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

靶向Livin基因siRNA载体的构建和沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察该载体对食管癌细胞Livin基因表达的沉默效应。方法:依据siRNA设计原则,分析Livin mRNA序列,设计并合成2个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pSUPER-neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹法将重组质粒转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR检测转染细胞Livin mRNA的表达。结果:经过酶切鉴定与测序,构建的靶向Livinα和Livinβ基因的siRNA载体,结果正确;RT-PCR检测显示,转染细胞Livin mRNA的表达水平降低。结论:成功构建沉默细胞Livin基因表达的siRNA载体。