焦磷酸测序法在败血症常见病原体检测中的应用

目的将焦磷酸测序技术应用于败血症常见病原体的检测鉴定。方法根据细菌16S rRNA序列的特点,设计焦磷酸测序
用的PCR扩增引物和测序引物,提取败血症常见病原体的基因组DNA,进行焦磷酸测序,分析获得的序列,进行比对,对病原体
种类作出判断。结果经焦磷酸测序可以获取有效长度28 bp的序列,使用该测序序列可以有效区分化脓性链球菌、肺炎链球
菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、脑膜炎双球菌、沙门氏菌,但不能区分金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。结论
应用焦磷酸测序可以较有效地对败血症常见病原体的种类实现种属水平的区分。
     

16S rRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究

目的建立以16S rRNA基因序列分析为基础的细菌鉴定方法,并初步将其应用于临床常规细菌的鉴定。方法选择临床微生物实验室不能准确鉴定的细菌,以16S rRNA为靶序列,在两端保守区设计引物,PCR反应扩增目的片段,测序后与数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行序列比对。结果 13株菌中,有11株与数据库中的已知16S rRNA序列相似性达99.0%以上,成功鉴定到种的水平。结论 16S rRNA基因序列分析的方法可快速、准确地鉴定不典型菌株,可作为细菌常规鉴定的补充方法。     

口腔需氧菌及兼性厌氧菌种分离鉴定系统的建立

目的建立口腔需氧菌和兼性菌的系统分离鉴定方法。方法招募20名口腔健康志愿者及8名口腔疾病患者,分别采集唾
液、龈下菌斑、龈上菌斑和根尖周肉芽样本,采用形态鉴定、全自动生化鉴定仪及16s rRNA基因测序的多相分类方法,对口腔可
培养细菌进行分离鉴定。结果鉴定出口腔菌种63种,共175株,梅里埃生化鉴定与16s rRNA基因鉴定的符合度为22.39%,不
符合的菌种以基因测序结果为准。链球菌属、放线菌属和葡萄球菌属检出率占前3位,菌种以咽峡炎链球菌、口腔放线菌、变异
链球菌、缓症链球菌检出频率最高。慢性根尖周炎的咽峡炎链球菌检出率最高;放射性龋患者中,中间链球菌、金黄色葡萄球菌
检出率较高;猛性龋患者中,变异链球菌远高于其他细菌。结论口腔需氧菌和兼性厌氧菌中以革兰阳性菌检出率最高。对
于口腔细菌鉴定来说,梅里埃生化鉴定仪鉴定准确率不高,但可提供菌株生理生化指标,而全长的16s rRNA基因测序鉴定更
为可靠。
     

微阵列数据处理平台设计与实现

摘要：目的研制一个基于高性能计算机和Linux下运行的采用B/S模式的微阵列数据处理平台。方法构建以Apache服
务器为平台的WEB服务器,采用Perl语言编程,整合R语言与Bioconductor中的微阵列数据分析软件包,满足寡核苷酸微
阵列和双色点样微阵列实验数据的处理和分析,用户可在网页上提交数据和设置参数,结果通过网页以图形化的方式返
回。结果该平台可处理寡核苷酸微阵列和双色点样微阵列的数据,实现了数据质量评估、预处理、注释、统计分析等功
能,操作简单,分析速度快。运用本平台处理了结核杆菌不同临床分型的人类巨噬细胞寡核苷酸微阵列数据,即潜伏期、
结核病、结核性脑膜炎,为识别结核杆菌的敏感基因提供了线索。利用本平台还分析不同条件下用异烟肼处理结核分支
杆菌的效果,例如低氧条件和敲除katG基因的条件所获得的相关cDNA微阵列数据,发现用异烟肼处理的对数生长期调
节的基因将不会在休眠期模型中被差异调节;并且在休眠期,被差异调节的基因总数将减少。结论该平台功能资源整合
较全面,克服了当前微阵列数据分析软件或工具包在操作使用方面的不足,应用界面友好,结果显示直观,为生物学家开
展微阵列数据分析提供了方便。针对结核分支杆菌的案例研究验证了平台的有效性。
     

大数据：基于高通量测序的抗体组学发展与应用

抗体是获得性免疫系统的主要组分,在防御性及致病性免疫反应中起着关键作用。对抗体发生、发展和成熟过程的解
析,对研究传染性疾病致病机制、疫苗设计、自免疫疾病发生及进展等有着重要意义。随着高通量测序技术的发展和成熟,抗体
研究进入了组学时代。通过对艾滋病患者外周血抗体谱的高通量测序及后续大数据分析挖掘已经在HIV-1广谱抗体研究中取
得了丰硕的成果。随着测序技术的进一步发展、测序长度的增加及精度的提高、实验体系的优化、分析流程标准的建立及单细
胞抗体测序技术的应用,抗体组学研究前景广阔。本文就抗体组学的技术、发展、应用及问题作简要综述。
     

不同测序方法在病原微生物鉴定中应用的研究进展

快速准确的微生物鉴定有利于指导临床治疗用药和控制传染病流行。传统病原微生物鉴定耗时且应用范围有限,越来越多测序方法被用于病原微生物研究。现从16S rRNA测序在细菌鉴定分析中的应用、18S rRNA和转录间隔区序列（internally transcribed spacer sequences, ITSs）在真菌或寄生虫等真核微生物鉴定分析中的应用、全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）在可分离培养的单个微生物鉴定中的应用、宏基因组测序（metagenomic sequencing,MGS）在未知感染的微生物检测中的应用进行综述,以期为病原微生物的鉴定方法提供参考。     

饮水中地塞米松污染对小鼠肠道菌群的影响

目的探讨水环境地塞米松污染对小鼠肠道菌群的影响。方法将20只Balb/c小鼠随机分为对照组和实验组,每组5只。
实验低剂量组灌喂含0.035 ng地塞米松磷酸钠的饮用水,中剂量组为0.225 ng、高剂量组为2.25 ng,对照组灌喂不含地塞米松磷
酸钠的饮用水。每日观察小鼠行为、皮毛、大便等的变化。灌喂第36 d 处死小鼠,取回盲部组织提取细菌基因组DNA,扩增
16S rDNA V6可变区,扩增产物变性凝胶梯度电泳（DGGE）后分析。切取DGGE图谱上的优势条带,扩增、纯化后克隆测序,其
序列BLAST比对分析。结果各实验组小鼠均出现性情暴躁、斗殴打架、咬断尾部等现象。DGGE图谱聚类分析表明各组小鼠
回盲部均具有较稳定的菌群;主成分分析表明各组的优势菌群存在一定差异;菌群多样性分析表明,与对照组相比,低剂量组菌
群的种类和数量明显增加（P<0.05）;中、高剂量组种类和数量显著增加（P<0.01）。16S rDNA V6区序列分析显示实验组和对照
组具有共有菌属15种、差异菌属2种,优势菌种类和比例发生了改变。对照组有乳杆菌属的细菌定植,而中、高剂量实验组乳杆
菌属的细菌消失,却出现志贺菌属的细菌。结论饮水地塞米松污染可影响小鼠神经系统,使小鼠肠道内细菌的种类、数量及优
势菌所占的比例发生改变,菌群多样性增加;抑制肠道益生菌的定植,利于肠道致病菌的入侵。
     

比较全自动微生物分析仪与基因分析在凝固酶阴性葡萄球菌鉴定中的作用

目的比较Vitek32鉴定系统和16S rRNA序列分析法鉴定凝固酶阴性葡萄球菌的灵敏度和特异性。方法选择2004年12月~2006年11月重症监护病房分离的凝固酶阴性葡萄球菌70株,常规细菌培养后,用Vitek32鉴定系统和16S rRNA基因测序进行分类,以AP IStaph系统为参照,比较2种鉴定方法的优势和不足。结果根据Vitek32鉴定系统判断标准,将鉴定结果分为3组:Ⅰ组(25株):“不可接受”,%id<80;Ⅱ组(35株):“可接受的”,%id80~90;Ⅲ组(10株):“好的”,%id90~98,标准菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC29213),分别进行16S rRNA基因测序。16S rRNA基因分析法全部鉴定到种,2种方法鉴定符合率分别为Ⅰ组64%、Ⅱ组74.3%、Ⅲ组100%,总体鉴定符合率74.4%。结论Vitek32在进行凝固酶阴性葡萄球菌鉴定时有局限性,16SrRNA序列分析可以弥补鉴定上的不足,在发展难培养和不能培养微生物的鉴定中将发挥重要作用。     

幽门螺杆菌感染对小鼠食道下端菌群的影响

目的通过小鼠动物模型,检测幽门螺杆菌感染后食道下端菌群的变化,探讨其与食道下端疾病发生的关系。方法将30
只BALB/C小鼠随机均分为阴性对照组和感染组。感染组通过灌喂幽门螺杆菌菌液建立动物感染模型,两组小鼠均在末次灌
喂菌液4周后同时处死,取食道下端组织提取细菌的DNA,以原核生物16S rDNA V6区通用引物采用聚合酶链反应-变性梯度
凝胶技术（PCR-DGGE）对V6区进行扩增,用Quantity-One 1-D Analysis software.对DGGE图谱进行菌群分析,并将DGGE图
谱上的组间差异条带用16S rDNA V6区引物分别扩增后,DNA测序,BLAST比对分析。结果DGGE指纹图谱分析显示,实验
组DNA条带数量极显著高于对照组（P<0.01）,多样性指数、丰富度指数均显著高于对照组（0.01好地在相似性系统树中分开,主成分分析不同组的菌群分别聚集在不同的位置,BLAST比对分析感染组出现特有细菌。结论
食道下端定植着以乳杆菌、拟杆菌为优势菌的稳定菌群,幽门螺杆菌感染后菌群结构变化为以葡萄球菌、不动杆菌、无芽胞杆菌
为优势菌的菌群。
     

转基因番茄Zeneca B,Da,F实时荧光定量PCR检测体系的建立

摘要：目的构建转基因番茄Zeneca B,Da,F品系的质粒标准分子及其实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系。方法基于反
向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因apx检测序列（ERG-apx）,转基因番茄B,Da,F品系pg基因的基因特异性序列
（GS-pg）及其构建特异性序列（CS-16S、CS-16A）的番茄内参质粒标准分子pEasy-T3-APX,转基因番茄B,Da,F品系的构
建特异性质粒标准分子pEasy -T3- 16A、pEasy-T3-16S;以Beacon Designer 7.5设计用于定性PCR和qPCR检测的引物对
和Taqman探针;基于质粒标准分子建立了定性PCR和qPCR检测体系,对方法的特异性、敏感性、重复性、检测下限等指
标进行评估;使用PicoGreen 试剂盒对质粒标准分子进行定量,以质粒pEasy-T3- APX 为背景DNA 定量混有
pEasy-T3-16A或pEasy-T3-16S制备成含量为1%和0.1% (w/w)的两组核酸标准物质,进行所构建qPCR检测体系的定量
性能评价。结果锚定qPCR检测靶序列：ERG-apx 108 bp, GS-pg 108 bp,CS-16S 109 bp、CS-16A 102 bp;酶切鉴定所构
建的质粒标准分子均可得到预期大小的插入子片段;所建立的实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系,重复性的相对标准差
（RSD）0.2%~1.5%,检测下限25 copies,标准曲线方程线性关系R2值在0.994~0.998,效率在93.3%~102.4%。经换算系数
Cf换算,对PicoGreen定量的样品进行验证,其实测值与真值的偏差是-9.7%~17.3%。结论成功构建了转基因番茄Zeneca
B,Da,F品系的质粒标准分子及其qPCR检测体系,为转基因番茄Zeneca B,Da,F品系转基因成分的监测建立了可行的
可供使用的定性与定量检测体系。
     

16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的: 运用16S rRNA 基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法: 提取细菌DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA 基因片段并测序。将测序结果用Blastn 在线软件在Nucleotide 数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果: 12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。 结论: 16S rRNA 基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

菌群培养组学及其在皮肤病研究中的应用进展

 皮肤菌群在维持皮肤稳态中发挥重要作用并参与多种皮肤疾病的发生发展。既往研究主要通过高通量测序技术揭示人体皮肤菌群的组成和特征,但这一技术存在偏倚和局限,且难以深入开展单个菌株的功能研究。培养组学通过高通量培养技术分离菌株,结合质谱技术和16S rRNA测序鉴定菌种,进而深入分析菌株功能,可以挖掘生理状态下皮肤菌群多样性,同时推动疾病状态下皮肤共生细菌物种和菌株水平的研究。健康人皮肤菌群培养组学增加了可培养的皮肤细菌数量,并揭示了皮肤菌群碳源利用模式的多样性和皮肤菌群的个体特异性。培养组学可以动态观察皮肤病治疗过程中皮肤菌群的变化,揭示维持皮肤菌群多样性对皮肤稳态的重要意义,并筛选得到在银屑病、皮肤慢性创伤等皮肤病治疗中有益的特定菌株。随着培养组学方法的完善及多组学联合运用的发展,菌群培养组学将成为皮肤病学研究不可或缺的重要方法。     

16SrRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的：运用16SrRNA基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法：提取细菌DNA,采用通用引物PcR扩增16SrRNA基因片段并测序。将测序结果用Blastn在线软件在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果：12种细菌可以鉴定到“种”,2种细菌可以鉴定到“属”。结论：16SrRNA基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。     

基于16s rRNA高通量测序分析糖尿病足骨髓炎感染骨组织中的病原微生物

目的 利用16s rRNA高通量测序技术分析糖尿病足骨髓炎(DFO)感染骨组织中病原微生物特点,为临床感染病原菌的鉴定及治疗提供快速、准确的方法.方法 收取2016年9月~2017年4月于本科室住院的16例DFO患者清创术中获取的感染骨标本,分别利用16s rRNA高通量测序技术和血培养分析仪进行病原微生物的鉴定,分析16s rRNA测序结果中DFO的菌群特点,并与培养结果相比较.结果 16s rRNA测序显示DFO骨组织病原微生物多样性较大,分布较为均匀,共获得优势菌属20种,占所有菌属的87.00%,其中Prevotella是丰度最大的菌属.两种鉴定方法结果均显示DFO病原菌以革兰氏阴性菌为主.与培养法相比,16s rRNA测序阳性率较高(100%vs 88.24%),平均每个样本病原菌数较多(12.56 vs 1.50),革兰氏阴性菌所占的比例较高(67.16%vs 50.00%).此外,16s rRNA测序结果覆盖了除Escherichia coli、Serratia marcescens及Enterobacter cloaca外的所有培养病原菌结果,甚至有高达13种菌属不存在于培养结果,其中Anaerococcus、Veillonella、Bacteroides、Fusobacterium、Porphyromonas、Finegoldia、Prevotella、Peptostreptococcus、Parvimonas、Peptoniphilus和Bulleidia均为专性厌氧菌或严格厌氧菌,而培养结果中并无厌氧菌的出现.但培养结果显示,DFO中多重耐药菌的比例高达58.33%.结论 16s rRNA高通量测序能较好展示DFO骨组织中菌群微生态的多样性及丰度特点.DFO骨组织病原微生物多样性大,分布均匀,但优势菌属分布离散,以革兰氏阴性菌为主.与培养法相比,16s rRNA测序对病原菌的鉴定简单而准确,尤其在对革兰氏阴性菌和厌氧菌鉴定方面有显著的优势,可快速而准确地指导DFO感染治疗.     

功能性消化不良患者唾液菌群的研究

目的 分析功能性消化不良患者与健康对照者唾液菌群的差异.方法 收集功能性消化不良患者及健康对照者的唾液标本,提取总基因组DNA,采用高通量测序技术对样本中细菌的16S rRNA-V4区进行DNA测序后进行生物信息学分析.结果 功能性消化不良组唾液中的菌群以变形菌门为主,健康对照组以拟杆菌门为主.功能性消化不良唾液菌群的Chao1、ACE、Shannon指数分别为1 295、1 351、4.93,健康对照组为1 001、1 019、5.28.PCoA可基本将两组间的唾液菌群区分开.LEfSe分析发现两组间有差异菌群共有16个,包括普式菌属、奈瑟菌属及变形菌门等.结论 功能性消化不良患者唾液有其特征性的菌群组成,以变形菌门为主,但两组间的丰富度及多样性无差别,奈瑟菌属是两组间差异显著的细菌之一.     

Microbial diversity in failed endodontic root-filled teeth

Background  Persistent/secondary infections of human root canals play an important role in the failure of endodontic treatment. This study used 16S rRNA sequencing to assess microbial diversity in root-filled teeth associated with failed endodontic treatment.

Methods  DNA was extracted from 15 teeth with persistent intraradicular infections, and the 16S rRNA of all present bacteria were amplified by PCR, followed by cloning and sequencing of the 16S rRNA amplicons.

Results  All sample extracts were positive for PCR amplification using the universal 16S rRNA gene primers. Negative control reactions yielded no amplicons. Sixty-five phylotypes belonging to seven phyla were identified from 760 clones; a mean of 9.4 phylotypes were detected in each sample (range 3–15). Twenty-eight phylotypes were detected in more than one sample, revealing a high inter-sample variability. Parvimonas micra (60%, 9/15), Solobacterium moore (47%, 7/15), Dialister invisus (33%, 5/15), Enterococcus faecalis (33%, 5/15), Filifactor alocis (27%, 4/15), and Fusobacterium nucleatum (27%, 4/15) were the prevalent species. Nineteen as-yet-uncultivated phylotypes were identified, comprising a substantial proportion of the bacteria in many cases.

Conclusions  Persistent intraradicular infections were present in all root-filled teeth associated with failed endodontic treatment. The current observations reveal new candidate endodontic pathogens, including as-yet-uncultivated bacteria and phylotypes that may participate in the mixed infections associated with post-treatment apical periodontitis.

     

基于16S rRNA序列鉴定临床不常见细菌

目的以16S rRNA基因为靶序列,建立核糖体测序方法鉴定临床不常见细菌。方法利用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增细菌16S rRNA基因,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn分析。结果10株临床常见细菌测序结果与表型鉴定符合,检测出4株临床不常见细菌。结论 16S rRNA基因测序可以作为鉴定临床不常见细菌的重要方法之一。