建立反向斑点杂交法快速诊断HBV拉米夫定耐药位点

目的：基于多重PCR和反向线性杂交原理,建立乙肝病毒（HBV）耐药突变检测的新方法,探讨HBV与药物应答的关系。方法：通过序列分析,设计生物素标记的引物,扩增HBV聚合酶逆转录区基因。同时设计能检测出拉米夫定（LAM）常见耐药突变位点的特异性探针。样本经PCR扩增后与固定至尼龙膜条上的探针杂交,用BCIP/NBT系统显色,观察结果。结果：实验建立的反向线性杂交法显色后斑点出现的耐药位点与测序结果相一致。结论：检测结果与测序结果具备良好一致性,用反向线性杂交法建立的测定HBV耐药位点的具有操作简便,快速、敏感、高通量的特点。     

LDR法检测HBV P基因区野生型和突变型片段

目的 探讨连接酶检测反应(LDR)方法同时检测HBV P基因区野生型和突变型片段的可行性.方法 针对拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的 片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读.应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性.结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBVDNA大于106copies/ml患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致.结论 血清HBVDNA大于106copies/ml时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗.     

巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒耐药基因检测中的敏感性与特异性分析

目的评价巢式PCR联合焦磷酸测序法在乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因检测中的敏感与特异性。方法选取rtM204I(ATT)突变型和rtM204(ATG)未突变型质粒,按照不同比例混合后,采用巢式PCR联合焦磷酸测序法对突变位点进行检测,并与常规PCR焦磷酸测序法进行比较,对两种方法的线性及一致性进行分析;选取不同病毒载量临床标本,采用巢式PCR焦磷酸测序法检测耐药突变位点,并与巢式PCR Sanger测序法进行比较,对两种方法的敏感性及特异性进行分析。结果常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果拟合曲线R2>0.99,P<0.05,线性模型有显著性意义。分别将常规PCR焦磷酸测序和巢式PCR焦磷酸测序结果与预测值的差值进行分析,巢式PCR能够较常规PCR更好的反映实际值,在90%比例处优于常规PCR。临床75例患者标本巢式PCR Sanger测序与巢式PCR联合焦磷酸测序结果灵敏性比较提示,Sanger测序的灵敏性为92%,巢式PCR联合焦磷酸测序的灵敏性达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。对于不同病毒拷贝数标本的灵敏性不同,其差异主要表现在低浓度组(HBV DNA≤3log10 copies/ml),Sanger测序的灵敏性为78%,而焦磷酸测序的灵敏性可以达到100%,差异有统计学意义(P<0.01)。阴性对照,两种方法均未检出HBV病毒,两种方法的特异性均较好。结论巢式PCR联合焦磷酸测序的方法监测乙肝病毒变异同巢式PCR联合sanger测序相比,有更好的灵敏性,尤其是在低病毒拷贝数时,差异明显,这对于临床提早发现耐药突变株,指导临床及时更换用药有重要意义。     

一种新的HBV DNA rtA181T耐药突变检测方法

目的:通过巢式PCR及特异引物,建立一种新的乙肝病毒(HBV) DNA rtA181T耐药突变的PCR直接扩增检测方法?方法:巢式PCR方法第1轮扩增HBV DNA 逆转录酶rt活性域片段,第2轮PCR上游引物3′末端碱基设计为与HBV DNA rtA181T突变碱基相同的碱基,扩增出的目的基因片段,即为突变片段?利用该方法,本文检测了43例HBV DNA rtA181T变异标本,分析该方法检测的灵敏性;并比较分析低拷贝HBV DNA水平与高拷贝HBV DNA水平下,该方法与PCR-Sanger测序法检测HBV DNA rtA181T突变的一致性?结果:产物经测序证实,突变检测引物巢式PCR法能扩增出HBV DNA rtA181T耐药突变?在HBV DNA水平为24 U/?滋L?rtA181T突变株含量低至10%时,该方法仍能较好检测出rtA181T变异片段?对43例不同拷贝水平的HBV DNA rtA181T耐药变异临床标本检测显示,该方法检测灵敏性达100%,常规PCR-Sanger测序灵敏性为74%,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:基于巢式PCR及突变引物为基础的HBV DNA rtA181T耐药突变PCR直接检测法能较好地检测HBV DNA rtA181T耐药变异发生;对HBV DNA低拷贝水平下的rtA181T耐药变异检测,该方法灵敏性优于Sanger测序法,且有较好的特异性?这对早期发现HBV DNA耐药突变?及时更改抗HBV治疗策略具有重要临床指导意义?     

慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗不同阶段HBV DNA多聚酶分析

目的分析拉米夫定治疗不同时期HBV DNA多聚酶区耐药突变的变化规律和主要耐药突变的分布情况。方法将接受拉米夫定治疗的98例患者根据治疗时间进行分组,采用PCR方法对其血清HBV多聚酶区进行扩增并对聚合酶链反应（PCR）产物进行直接测序。结果拉米夫定治疗后血清HBV DNA水平≥10^4copies／ml的患者中,治疗时间〈6个月6例,其中1例发生突变;6～12个月13例,其中7例发生突变;12～24个月19例,其中13例发生突变;24～36个月20例,其中19例发生突变,各组之间耐药突变发生率比较差异有统计学意义（P〈0．05）。耐药患者中有10种突变类型,其中以rtM204I突变最多见,为14例（35．0％）,其次为rtL180M／M204V（17．5％）、rtL180M／M2041（12．5％）。结论对拉米夫定治疗6个月以上而没有达到病毒学完全应答的患者进行乙肝病毒基因耐药突变的检测,有助于及时准确的调整治疗方案。     

HBV拉米呋啶耐药相关基因及HBV基因分型的初步研究

目的：利用基因测序技术，根据HBV S基因序列和HBV P基因区YMDD基因序列的特征，建立一种既可以诊断HBV基因型，又能检测拉米呋啶耐药突变的简便、可靠的方法。方法：采用特异的引物对待检标本进行PCR扩增后作基因序列检测，利用Chromas2．23软件对测序结果进行分析有无突变产生，测序结果用软件DNASIS进行基因分型分析。结果：61例经拉米呋啶治疗的慢性乙肝患者B型11例（18％），C型50例（82％）。发生YMDD变异47例，变异检出率为77．0％。结论：该方法能同时检测HBV基因型和YMDD变异，可以通过准确的P基因序列测定区分YMDD变异的类型，并可根据需要监测其他的伴随突变，进一步进行核苷酸多态性分析，对临床治疗和病情监控均有指导意义。     

替比夫定抗病毒治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBV P基因RT区序列突变模式及耐药率的改变

目的：通过研究替比夫定治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBV P基因RT区序列突变模式及耐药率的改变,探讨替比夫定的主要耐药变异模式及耐药率。方法：应用重组克隆测序检测法检测47例接受替比夫定治疗1、2、5年的慢性乙型肝炎患者HBV P基因区序列。结果：应用替比夫定治疗1年者有2例（4.26%）出现常见变异位点,P基因区突变模式均为rtM204I;治疗2年者有10例（21.28%）出现变异位点,9例突变模式为rtM204I,1例突变模式为rtL180M+rtM204I;治疗5年者有24例（51.06%）检测到替比夫定常见变异位点,16例（66.7%）变异模式为rtM204I、4例（16.7%）为rtL180M+rtM204I,另外还有rtL181V+rtM204I、rtM204V、rtM204I+rtN238H、rtL180M +rtM204I+rtD263E各1例。结论:替比夫定的主要耐药变异模式为rtM204I和rtL180M+rtM204I。替比夫定治疗1、2、5年的耐药率分别为4.26%、21.28%和51.06%。提示替比夫定的5年耐药率明显低于拉米夫定的4年耐药率,但替比夫定的耐药率高于阿德福韦酯。     

核苷(酸)类药与乙型肝炎病毒P基因变异特点及突变频率的关系

目的 观察核苷(酸)类药治疗不同时间段慢性HBV感染患者血清乙型肝炎病毒聚合酶(HBV P)基因序列变异特点及突变频率.方法 以乙型肝炎病毒全序列为参照,针对P区目的 位点,参考引物设计原则,运用焦磷酸测序仪器配套的软件Assay Design SW在目的 区域两端保守区域设计PCR引物及测序引物,采用套式PCR方法检测血清中HBV DNA,按照PyroMark ID遗传分析系统用SNP模式进行PCR产物 HBVP基因相关位点的焦磷酸测序、突变频率检测,同时测定患者血清HBVDNA、HBVM、ALT.结果 34例患者中16例发生变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,加少量V173L突变,发生变异者耐药突变型在样本中所占比例由20%到100%;HBVP基因变异可以在HBVDNA、ALT发生突破前、中、后检出;发生HBeAg转化者P基因变异率较低.结论 焦磷酸测序可以快速、准确的检测出HBVP基因变异; HBVP基因变异模式、突变频率与核苷类药物敏感性密切相关.     

测序法分析乙肝病毒P区耐药突变

目的调查乙型肝炎患者血清HBV P区基因序列的突变情况。方法选取聊城市人民医院2011年5月-2012年7月期间120例接受核苷类药物治疗后的乙型肝炎患者作为研究对象,采用荧光定量PCR产物直接测序法,对扩增产物进行测序,分析各个耐药位点。结果在120例乙型肝炎患者中存在位点突变者67例（55.8%）,以rtM204I/V,rtL180M和rtA181V/T突变居多,分别占38.5%、26.0%和20.5%。rtV173L、rtN236T和rtI233V有少量突变,大多以联合突变形式出现。结论乙型肝炎患者在接受核苷类药物治疗后,HBV P区可检出突变,突变形式多样,应用测序法分析HBV P区基因突变,获得信息全面,对评估病情和实施抗病毒治疗有重要价值。     

HBV BCP区1762/1764和1896突变位点检测新技术研究

目的：利用错配扩增和荧光PCR原理,建立一种针对HBV BCP区1762/1764和前C区1896突变位点的新型检测方法---错配扩增突变分析PCR法（MAMA-PCR）,并对该方法进行临床评价。方法：a）MAMA-PCR突变检测方法性能评估：以野生和突变性阳性参考品作为模板检测3次,分析该方法稳定性;将突变型和野生型质控品梯度比例混合,分析该方法检测混合感染的检测效率。b）测序法、商品化试剂盒与本方法同时检测样本并对MAMA-PCR方法做出评价。结果：MAMA-PCR 3次检测重复性良好,CV值均小于5%,且可稳定检出含1%突变含量的混合样本。132例HBV样本中,1762/1764双突变位点测序法检出67例,ARMS-PCR试剂盒检出69例,MAMA-PCR检出69例,突变检出率分别为50.8%、52.3%和52.3%;1896突变测序法检出39例,ARMS-PCR试剂盒检出41例,MAMA-PCR检出42例,突变检出率分别为29.5%、31.1%和31.8%。结论：MAMA-PCR 检测方法性能稳定,突变检出率高于测序法,与商用试剂盒基本一致,可用于临床乙肝患者 BCP区1762/1764双突变和前C区1896突变位点的快速检测。