VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及与活性测定

目的：探讨人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法：制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞，收获转染后24h至6d的转染上清和细胞，采用RT－PCR技术，免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达，用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞，接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中，对其进行体外诱导分化培养，以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养，表达内皮细胞的特异性抗原，包括VWF、CD31和CD34，并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL），结合UE小1等内皮细胞特性，提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs，在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

转化生长因子β1对内皮细胞屏障功能的影响

目的观察转化生长因子β1（TGF-β1）对体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926屏障功能的影响并探讨其作用机制。方法体外培养EA.hy926脐静脉内皮细胞株,实验分为两组,对照组培养液中加入PBS;TGF-β1处理组培养液中添加0.01mg/L的TGF-β1。将细胞在多聚脂滤膜上培养,测量细胞跨上皮电阻（TER）的变化。免疫荧光检测两组血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）、α-连环蛋白、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和纤维连接蛋白的表达变化;RT-PCR检测两组VE-cadherin和VEGF表达的变化。结果TGF-β1处理后TER降低,两组处理前后TER差值比较有统计学意义（t=3.294,P〈0.01）;TGF-β1处理组VE-cadherin和α-连环蛋白表达减少,内皮细胞黏附连接被破坏;而VEGF和纤维连接蛋白表达增多,基底膜增厚。结论TGF-β1可引起内皮细胞屏障功能的破坏,其机制可能与VEGF的表达上调有关。     

白细胞介素2激活的外周血和脐带血及骨髓单个核细胞培养上清对骨髓造血的影响

目的：探讨用白细胞介素2（IL-2）激性的外周血（APB）和脐带血（ACB）及骨髓（ABM）单个核细胞的培养上清,对骨髓造血的影响和作用的可能机制。方法：应用MTT法,在体外同时检测APB和ACB及ABM培养上清,对骨髓和外周血单个核细胞增殖能力的影响;同时用集落培养法,检测这3种上清对骨髓粒-单细胞集落和成纤维细胞集落形成能力的影响。结果：加入APB和ACB及ABM培养上清,对正常骨髓和外周血单个核细胞增殖能力,以及粒-单细胞集落和成纤维细胞集落形成无显著的影响。结论：应用IL-2对自体干细胞移植物进行体外净化时,培养上清对正常造血细胞和单个核细胞无显著影响。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性.方法制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性.结果VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性.结论VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF.     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

乌司他丁对重症中暑血管内皮细胞损伤保护作用

目的：观察乌司他丁对重症中暑血管内皮细胞损伤的影响。方法：检测重症中暑患者外周血循环血管内皮细胞（CEC）数量和血清vWF及TM溶度；重症中暑血清攻击体外培养脐静脉，检测培养上清脱落血管内皮细胞数量和可溶性vWF及TM浓度。观察乌司他丁治疗对重症中暑CEC数量和血清vWF及TM浓度的影响；重症中暑血清攻击脐静脉，观察乌司他丁对培养上清血管内皮细胞数量和可溶性vWF及TM浓度的影响。结果：重症中暑患者组外周血CEC明显高多于健康对照组（P<0.05）；重症中暑组血清vWF和TM浓度高于健康对照组（P<0.05）。重症中暑血清可明显损伤脐静脉内皮细胞，培养上清血管内皮细胞数量明显增加（P<0.05），培养上清vWF和TM浓度明显升高（P<0.05）。重症中暑乌司他丁治疗可明显减少CEC（P<0.05），同时下调血清vWF和TM浓度（P<0.05）。体外实验发现乌司他丁对重症中暑血清损伤脐静脉内皮细胞具有保护作用，其培养上清脱落血管内皮细胞数量明显减少（P<0.05），培养上清vWF和TM浓度下降（P<0.05）。结论：重症中暑存在严重的血管内皮细胞损伤，乌司他丁对于重症中暑血管内皮细胞损伤具有一定的保护作用。     

骨髓来源血管内皮前体细胞的培养方法

目的: 明确骨髓单核细胞中是否存在血管内皮前体细胞(EPCs),在不同的培养条件下,细胞的增殖、分化是否受影响. 方法: 取SD大鼠股骨,用密度梯度离心法收集骨髓单个核细胞,分为3组,接种在EC基础培养基上:A组,在培养液中添加VEGF, bFGF;B组,与人脐静脉细胞共培养;C组为对照组. 分别在培养的第3, 7, 11和15日时,将细胞进行免疫荧光染色,流式细胞仪检测细胞总数、抗体标记阳性的细胞百分比. 结果: 培养7 d后,细胞逐渐成为梭形,呈现内皮细胞样的表现型,免疫荧光显示,细胞呈现Ⅷ factor relative antigen 及NOS3抗体阳性标记,说明细胞已分化为内皮细胞. 其中B组细胞总数、Ⅷ factor relative antigen 及NOS3的阳性细胞百分比均高于A, C组,有统计学差异(P=0). 结论: 骨髓细胞中存在EPCs,并可在体外分化为血管内皮细胞,与脐静脉内皮细胞共培养可一定程度地弥补生长因子的缺乏,但无法替代添加VEGF和bFGF.     

血小板源性生长因子对于培养内皮细胞血管内皮细胞生长因子水平的影响

通过免疫组织化学的方法,观察血小板源性生长因子（PDGF）对于培养脐静脉内皮细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）水平的影响,揭示PDGF促进新生血管形成的机制。实验结果：缺氧培养时内皮细胞胞浆VEGF水平上升;不同剂量的PDGF在常规或缺氧培养条件下均能增加内皮细胞VEGF水平,且呈剂量依赖性,提示PDGF可能通过直接促血管形成生长因子的介导作用间接促进新生血管的形成。     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Thedevelopmentofgene therapieshas renderedits clinical application feasible.Vascular endothelialgrowth factor( VEGF) hasbeen approved to be usedfor clinical trials.VEGF plays an important role inangiogenesis and prevention of restenosis[1-8] ,butthelow efficiency of plasmid vector restricts its clinicalapplication.In this study,the h VEGF165c DNA wassubcloned into p ACCMV .p Lp A and subsequentlythis recombinant was co- transfected into 2 93cellswith p JM1 7to obtain the replication- …     

反义血管内皮细胞生长因子基因转染在调节人肺巨细胞癌血管生成及肿瘤生长

OBJECTIVE: To study the regulatory effect of antisense VEGF121 cDNA transfection on endogenous VEGF secretion and angiogenesis of human metastatic lung carcinoma cell line PG and explore the significance of microvessel density (MVD) in tumor growth and metastasis. METHODS: The eukaryotic expression vectors bearing antisense VEGF121 cDNA was transfected into PG cells. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were cultured in conditioned mediums from transfected cells, and proliferation was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and 3H thymidine incorporation (3H TdR) assays in vitro. Microvessel density (MVD) in xenografted tumors in nude mice was analyzed by immunohistochemistry. RESULTS: The transfectant of antisense VEGF121 cDNA exhibited a reduction in VEGF secretion. HUVEC grown in conditioned medium from the antisense VEGF transfected cells exhibited a decrease in capacities of DNA syntheses and cell proliferation. MVD of tumor with transfected antisense VEGF gene was significantly lower than that in control vector. CONCLUSION: Antisense VEGF gene transfection can inhibit vascular endothelial cell proliferation in vitro and tumor angiogenesis in vivo, which may explain its inhibitory effects on tumor growth and metastasis.     

反义血管内皮细胞生长因子基因转染在调节人肺巨细胞癌血管生成及肿瘤生长和转移中的作用

目的　探讨反义血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因转染在减少肿瘤细胞内源性血管内皮细胞生长因子分泌 ,调节肿瘤血管生成和肿瘤生长转移中的作用。方法　利用脂质体法将反义基因转染到高转移性人肺癌细胞 (PG) ,以转基因肿瘤细胞培养上清刺激人脐静脉内皮细胞 ,进行噻唑蓝 (MTT)和3H胸腺嘧啶 (3HTdR)掺入实验 ;并将转基因肿瘤细胞接种于裸鼠体内 ,应用免疫组织化学法检测肿瘤内微血管密度 (MVD) ,探讨MVD与肿瘤生长转移的关系。结果　反义VEGF基因的转染 ,使肿瘤细胞VEGF分泌减少 ,其培养上清刺激人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)生长活性较空载体组减弱 ,HUVEC之DNA合成减少 ,裸鼠移植瘤内MVD为 41个± 9个 ,空载体组为 5 8个± 10个 ,两组比较t=2 715 ,P <0 .0 5。结论　反义VEGF基因的转染使肿瘤细胞分泌VEGF能力下降 ,肿瘤血管生成能力降低 ,这在肿瘤的生长和转移调节中有重要意义。     

诱导正常血管内皮细胞具备肿瘤血管特性的研究

[目的]探讨用肿瘤细胞培养上清液诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是否具备肿瘤血管内皮细胞的特性,旨在寻找一种简便的方法,解决肿瘤血管内皮细胞不易获得的难题.[方法]HUVEC用含不同浓度人肝癌细胞株HepG2培养上清的条件培养液培养,3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑盐法(MTS)检测其增殖率,免疫细胞化学法结合图像定量分析测量血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤内皮标记物1和8(TEM1、TEM8)的mRNA表达.[结果]含体积分数10%、20%、40%HepG2培养上清的条件培养液培养,HUVEC增殖率分别为71%、89%、109%.HUVEC用含体积分数50%HepG2培养上清液的条件培养液培养后,VEGFR2平均光密度值明显高于对照组(P＜0.05),且TEM1及TEM8呈阳性表达,而对照组不表达.[结论]HepG2上清液促进HUVEC增殖,增殖后的HUVEC具备肿瘤血管内皮细胞的特性.     

人参皂甙对肺癌细胞和血管内皮细胞增生、凋亡及其周期的影响

目的：探讨中药20(R)-人参皂甙Rg3(Rg3)对肺癌细胞和血管内皮细胞增生、凋亡以及细胞周期的影响。方法：进行人肺腺癌细胞株A549、人脐静脉血管内皮HUVEC304细胞培养,不同浓度Rg3干预,采用MTT法、流式细胞术、透射电镜等技术,了解不同浓度Rg3对上述细胞增生、凋亡以及细胞周期的影响。结果：3×10-6 mol/L的Rg3可导致A549细胞明显凋亡,凋亡率为29.8%,与对照组(15.0%)相比差异有统计学意义（P<0.05）。Rg3对A549细胞周期的影响无显著差异。1×10-4 mol/L的Rg3对内皮细胞的生长抑制率为12.53%,显著高于其它组（P<0.05）,不同浓度Rg3对条件培养液（CM）诱导的血管内皮细胞的增生均有明显的抑制作用（P<0.05）,电镜下可见10-6 mol/L浓度的Rg3可使CM诱导的内皮细胞出现凋亡小体。 结论：适当浓度的Rg3有抗肿瘤作用和抑制肿瘤新生血管生成的作用。     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Summary To construct the recombinant adenovirus vector containing the cDNA for human vascular endothelial growth factor (hVEGF₁₆₅), the cDNA for hVEGF₁₆₅ was subcloned into pACCMV · pLpA. Subsequently, this recombinant pACCMV · hVEGF was co-transfected into 293 cells together with pJM17 to obtain the replication-deficient recombinant adenovirus containing hVEGF gene — Ad-CMV · hVEGF. The VEGF gene expression was detected by using RT-PCR and Western blot in rabbit aorta vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with AdCMV · hVEGF. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with the conditioned medium (CM) from above mentioned VSMC infected with AdCMV · hVEGF to observe the effect of VEGF on proliferation of HUVEC. 48 h after the infection with AdCMV · hVEGF, VSMC demonstrated VEGF expression, and the expressed VEGF could stimulate the proliferation of HUVECin vitro. Successfully prepared AdCMV · hVEGF₁₆₅ could express biologically active VEGF in infected VSMC, and stimulate proliferation of HUVEC.     

A study of endothelium-dependent proliferation of pulmonary smooth muscle cells in vitro

Summary The direct effect of hypoxia and the effect of hypoxic endothelial cells conditioned medium on cultured pulmonary arterial smooth muscle cells in vitro were studied with phase contrast microscopy,³H-thymidine labelled technique and flow cytometric measurements. The results showed that direct hypoxia inhibited proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, retained pulmonary arterial smooth muscle cells in the Go/G₁ phase and decreased³H-thymidine incorporation into pulmonary arterial smooth muscle cells and that hypoxic endothelial cells conditioned medium stimulated proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, promoted pulmonary arterial smooth muscle cells from G₀/G₁ phase to S phase and increased³H-thymidine incorporation into pulmonary arterial smooth muscle cells. It was reasonable to believe that hypoxia might enable pulmonary arterial endothelial cells to secrete some growth factors which could stimulate proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, thereby playing an important role in structural remodeling of the pulmonary arteries and in the development of hypoxic pulmonary hypertension.     

在高糖条件下锰超氧化物歧化酶刺激MSC提高血管内皮细胞活性的研究

目的观察高糖环境下,锰超氧化物歧化酶（MnSOD）刺激间充质干细胞（MSC）上清液对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）增殖和趋化能力的影响。方法高糖MSC培养基条件下,100μg／LMnSOD刺激的MSC为实验组,未刺激的MSC为对照组,添加Akt阻断剂5μmol／L.Tricirlbine为Akt阻断剂组,利用各组条件培养基在高糖1640培养基条件下,培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,使用MTr法观察各条件培养基对HUVEC增殖的影响,并利用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验对HUVEC的趋化情况进行评估。结果与对照组相比,MSC实验组条件培养基促进HUVEC增殖;但是Akt阻断剂组HUVEC增殖能力降低;MSC实验组条件培养基作用的HUVEC趋化活动与对照组相比明显提高,但MSC实验组HUVEC趋化活动在Akt阻断剂组明显被抑制;MSC实验组条件培养基中VEGF含量比对照组明显提高。结论高糖条件下MnSOD可以通过刺激间充质干细胞旁分泌VEGF等细胞因子对血管内皮细胞增殖、趋化等能力产生影响。     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性.将真核表达质粒pCD-hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线.结果发现VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖.提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因.     

骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞Angiogenin1，Angiogenin2基因的表达

目的：研究骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞表达成熟血管内皮细胞特异性基因,探讨为组织工程血管化提供种子细胞的可行性．方法：从SD大鼠后肢获取骨髓基质干细胞,进行体外扩增培养,取生长良好的第3代细胞体外诱导培养14d．细胞分诱导组（含内皮诱导因子VEGF和bFGF的完全血管内皮细胞条件培养基）和对照组（含M199普通培养基）．MTT法检测两组细胞增殖活性．免疫细胞化学法检测CD31,CD34蛋白的表达;RT—PCR检测细胞血管生成素1（Ang1）、血管生成素2（angiogenin2,Ang2）mRNA的表达．结果：MTT法检测发现,诱导组与对照组在1,2,3,4,5d5个时间点内,其细胞增殖活性无显著性差异（P1d=0．855,P2d=0．053,P3d=0．249,P4d=0．059,P5d=0．174）．免疫细胞化学检测结果CD34,CD31呈阳性表达．RT—PCR结果显示,诱导的血管内皮细胞表达成熟内皮细胞特异性基因Ang1,Ang2．结论：骨髓基质干细胞在一定诱导条件下可以表达血管内皮细胞特异性标志,可作为组织工程血管化理想的种子细胞．