人子宫内膜间质细胞原代培养及生物学行为的研究

目的探讨人子宫内膜间质细胞原代培养方法,并比较子宫内膜异位症(EMS)异位内膜间质细胞与正常子宫内膜间质细胞形态及生物学行为的差异,为EMS细胞模型的建立提供可靠依据。方法采用改良人子宫内膜间质细胞原代培养方法,免疫细胞化学法鉴定细胞类型,在光学显微镜下观察细胞形态差异,采用CCK8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况。结果正常子宫内膜间质细胞及EMS异位子宫内膜间质细胞分离培养成功率分别为93.33%、86.67%。两种间质细胞在生长速度、形态及生物学行为方面均具有明显差异。子宫内膜异位症异位内膜间质细胞(ESC)比正常子宫内膜间质细胞(NSC)增殖旺盛,增殖48 h、72 h时ESC的细胞相对增殖率明显高于NSC,差异均有统计学意义(P48h0.001;P72h0.001)。24 h、48 h、96 h的NSC凋亡率明显高于ESC,差异均有统计学意义(P0.001)。72 h时,NSC、ESC凋亡率比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论采用改良原代培养方法,可以明显提高人子宫内膜间质细胞培养成功率。体外细胞模型中异位内膜间质细胞的生长特性与子宫内膜异位症的疾病特点是一致的,可以成为疾病细胞机制研究的理想模型。     

异位子宫内膜间质细胞的分离培养及MMP2 9的表达和调节

目的：建立异位子宫内膜间质细胞分离培养方法,探讨异位子宫内膜间质细胞MMP2、MMP9的表达及调节。方法：收集16例子宫内膜异位症患者的异位内膜进行体外细胞分离及培养,用含肿瘤坏死因子α（TNF-α）的培养液诱导培养24小时,设立对照组,应用免疫组化及明胶酶谱法检测各组细胞中MMP2、MMP9蛋白的表达变化及其培养上清液中MMP2、MMP9的含量。结果：异位子宫内膜细胞中持续表达MMP2、MMP9,与对照组相比,异位内膜间质细胞经TNF-α作用后MMP9表达增高,培养上清液中MMP9的含量也显著增加。结论：成功分离培养了16例异位内膜间质细胞;异位内膜间质细胞持续分泌MMP2、MMP9;TNF-α可诱导MMP9的表达升高,这可能与异位子宫内膜间质细胞的侵袭转移密切相关。     

GnRHa对离体培养异位、在位内膜间质细胞生长抑制及分泌VEGF的影响

目的 研究GnRHa对子宫内膜异位症(简称内异症)患者离体培养异住、在位子宫内膜间质细胞生长抑制及分泌VEGF的影响.方法 体外原代培养人内异症异位、在位子宫内膜间质细胞,用10-10M、10-8和10-6M的GnRHa分别干预,用MTT法测定内膜间质细胞的生长增殖情况;用ELISA法测定其分泌的血管内皮生长因子(VEGF)浓度的变化.结果 GnRHa可抑制内异症异位及在位内膜间质细胞的生长增殖,呈剂量和时间依赖性(P<0.05).且对异位内膜问质细胞生长的抑制率明显高于在位(P<0.05);GnRHa可降低异位及在位内膜间质细胞分泌的VEGF的浓度,呈剂量依赖性(P<0.05),且高浓度(10-6M)对异位强于在位(P<0.05).结论 GnRHa可明显抑制子宫内膜异位症患者异住、在位子宫内膜间质细胞的生长,降低其分泌VEGF的浓度.     

左旋炔诺孕酮,雌二醇对离体子宫内膜细胞增殖的影响

[目的]观察左旋炔诺孕酮(LNG),雌二醇(E2)在体外对子宫内膜上皮细胞及间质细胞的影响.[方法]对20例人子宫在位内膜离体组织进行体外分离培养,细胞汇合后消化,一部分用盖片法培养,用特异性抗体鉴定细胞纯度,一部分在相同的生长期加入不同浓度的LNG,E2,培养24,48,72 h,用MTT法测定LNG,E2对子宫内膜上皮细胞及间质细胞增殖活性的影响;用流式细胞仪及DNA切口末端标记法测定LNG,E2对子宫内膜上皮细胞及间质细胞的增殖及凋亡作用.[结果]LNG浓度为5×10-5mol/L时,抑制细胞生长速度,促进细胞的凋亡;随药物作用时间延长,抑制作用加强,凋亡率增加.E2浓度为5×10-5mol/L时,促进细胞的增殖.两种激素同时作用,抑制细胞生长速度,促进细胞的凋亡.[结论]特定浓度的LNG对子宫内膜细胞生长有抑制作用,并诱导子宫内膜细胞凋亡;特定浓度的E2对子宫内膜细胞生长有促进增殖作用.     

NO/ET对异位子宫内膜间质细胞凋亡的影响

目的 :探讨NO和ET对异位子宫内膜间质细胞凋亡的影响。方法 :体外培养原位和异位子宫内膜间质细胞 ,应用ELISA检测内皮素表达 ,用硝酸还原酶法检测一氧化氮 ,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果 :与原位子宫内膜间质细胞相比 ,异位子宫内膜间质细胞NO和ET的合成增加 ,NO/ET比值下降 ,细胞凋亡率降低(P <0 .0 5 )。结论 :NO和ET单独应用时都不可能很好的解释异位子宫内膜间质细胞的凋亡 ,NO/ET比值可理想的解释这两个因子对细胞凋亡的影响。     

西红花苷对子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞生长周期的影响及机制研究

目的研究西红花苷对子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞生长周期及凋亡的影响,从细胞水平初步探讨西红花苷在子宫腺肌病中的治疗作用。方法 2018年1～6月收集江西省妇幼保健院术后病理确诊为子宫腺肌病标本,不同浓度西红花苷(0、200、300、400、500μg/m L)作用于异位子宫内膜间质细胞后,分别在培养0、24、48、72、96 h取出,CCK-8法检测细胞增殖; Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;PI单染检测细胞周期。结果 CCK-8法检测西红花苷浓度分别为200、300、400、500μg/mL作用细胞72 h后,细胞抑制率分别为(7.60±0.03)%、(11.50±0.10)%、(18.26±0.14)%、(20.62±0.09)%,浓度为400μg/mL、500μg/mL组增殖抑制率明显高于浓度为200μg/mL组,结果显示不同浓度西红花苷对子宫腺肌病异位内膜细胞增殖有明显抑制作用,与药物浓度及时间呈正比,随着西红花苷浓度的升高和作用时间的延长,对细胞增殖的抑制率也越高;不同浓度西红花苷作用细胞48 h后,流式细胞术检测到子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞凋亡率随浓度的增加而增大,细胞周期G0/G1期比例增多。结论西红花苷在体外能显著抑制子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞增殖,诱导凋亡,使细胞周期阻滞在G0/G1期,这些结果在细胞水平上显示西红花苷可用于临床治疗子宫腺肌病。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

孕三烯酮和米非司酮对子宫内膜异位症患者异位内膜及腹腔液巨噬细胞凋亡的影响

目的：对培养的异位子宫内膜及腹腔液巨噬细胞分组加入孕三烯酮及米非司酮药物,观察其细胞生长情况及形态学变化,同时进行细胞凋亡率检测等研究,探讨子宫内膜异位症的临床治疗。方法：对12例患子宫内膜异位症妇女异位子宫内膜的离体组织及腹腔液进行细胞培养,在相同的生长期,分别加入一定剂量的孕三烯酮或米非司酮后,观察细胞的生长状况并用流式细胞仪检测其凋亡率。结果：加入药物后,细胞的生长速度减慢,其凋亡率较未用药组明显增加,差异有显著性（P＜0．05）,而两种药物在同一种细胞,相同作用时间的凋亡率无统计学意义。结论：孕三烯酮及米非司酮对异位子宫内膜细胞及腹腔液巨噬细胞有抑制作用,并且可以诱导异位子宫内膜细胞及腹腔液巨噬细胞的凋亡。     

Rho／ROCK信号通路对在异位子宫内膜间质细胞NF－κB、MMP－9和TIMP－1表达的影响

目的：探讨 Rho／ROCK 信号通路激活后,在异位子宫内膜间质细胞中 NF －κB、MMP －9和 TIMP －1表达的变化情况及可能的作用机制,为临床提供新的治疗靶点。方法取90例卵巢处子宫内膜在异位病灶以及90例正常子宫内膜,分离、纯化间质细胞,建立体外间质细胞培养模型。酶免疫吸附的方法分析 ROCK Ⅰ激酶活性。 QPCR 法检测 NF －κB、MMP －9和 TIMP －1的转录水平,免疫印迹（Western blot）法检测 NF －κB、MMP －9和TIMP －1的蛋白表达水平。结果在异位子宫内膜间质细胞多呈梭形或者多角形,贴壁和增殖较快;在异位子宫内膜间质细胞的 ROCK Ⅰ激酶活性和转录水平显著高于正常子宫内膜（P ＜0.01）;在异位子宫内膜间质细胞的NF －κB、MMP －9转录水平和蛋白表达水平显著高于正常子宫内膜（P ＜0.01）,而 TIMP －1的转录水平和蛋白表达水平显著低于正常子宫内膜（P ＜0.01）。结论在异位子宫内膜间质细胞中 Rho／ROCK 信号通路处于激活状态,Rho／ROCK 信号通路激活以后,在异位子宫内膜间质细胞 NF －κB、MMP －9的表达均升高,TIMP －1的表达降低。其机制可能与该通路激活后引起下游基因表达变化有关。     

miRNA-221在EMS组织及间质细胞中的表达及对细胞增殖的影响

目的 探讨microRNA-221（miRNA）在子宫内膜异位症（endometriosis,EMS）患者组织及细胞中的表达及对EMS间质细胞增殖的影响。 方法 收集非EMS患者在位内膜（正常子宫内膜）及EMS患者卵巢异位内膜,分离培养及鉴定子宫内膜间质细胞,采用茎环法实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测在位、异位内膜组织及间质细胞中miRNA-221的表达;雌激素（17β-E₂,终浓度为10-8mol/L）刺激间质细胞48 h后检测miR-221-3p表达变化;异位间质细胞转染miR-221-3p inhibitor和inhibitor阴性对照（NC）后,观察其对miR-221-3p、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）表达和增殖的影响。 结果 miR-221-3p在EMS组织中的表达为正常子宫内膜组织的4.2倍（P=0.039）,在EMS间质细胞中的表达为正常子宫内膜间质细胞的2.66倍（P=0.029）。与正常子宫内膜组织及间质细胞相比,miR-221-5p在EMS组织及间质细胞中表达差异均无统计学意义（P>0.05）。雌激素处理正常及异位间质细胞48 h后miR-221-3p表达差异无统计学意义。抑制miR-221-3p功能后,异位间质细胞增殖抑制（P=0.018）,PTEN基因表达上调（P=0.021）。 结论 miRNA-221在EMS组织及间质细胞中表达上调,抑制miR-221-3p功能可促进PTEN表达从而抑制EMS间质细胞增殖。     

异位和正常子宫内膜间质细胞对上皮细胞间隙连接细胞间通讯的影响

目的 研究体外异位和正常子宫内膜间质细胞对内膜上皮细胞间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的不同影响.方法 取24例卵巢处子宫内膜异位灶以及10例正常子宫内膜,分离、纯化上皮细胞和间质细胞,建立体外上皮细胞单独培养、上皮细胞与间质细胞共培养模型.在激光共聚焦显微镜下采用荧光漂白后恢复技术分别检测各组上皮细胞的GJIC功能.结果 ①异位内膜上皮、间质细胞纯度分别为92%、95%,对照组内膜上皮、间质细胞纯度分别为95%、98%;②单独培养的异位内膜上皮细胞与单独培养的正常内膜上皮细胞的GJIC功能无显著性差异(P＞0.05);③与正常间质细胞共培养后,上皮细胞中GJIC功能明显上调,而与异位内膜间质细胞共培养的上皮细胞中GJIC功能未见明显变化.结论 异位间质细胞丧失了调节上皮细胞GJIC的能力,这种调节能力的异常可能与子宫内膜异位症发生有关.     

GnRH-Ⅱ对子宫内膜异位症患者离体培养的子宫内膜间质细胞分泌VEGF的影响

目的:检测体外培养的子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)患者在位和异位内膜间质细胞分泌的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)的浓度,并观察不同浓度的II型促性腺激素释放激素（GnRH-Ⅱ)对在位和异位内膜间质细胞分泌VEGF的影响。方法:分别给予原代培养的EMs患者在位与异位子宫内膜间质细胞不同浓度（1×10-10~1×10-6 mol/L)的GnRH-Ⅱ处理,不加GnRH-Ⅱ组作为对照,采用酶联免疫吸附法（ELISA)测定培养液中VEGF浓度并进行比较。结果:体外培养的EMs患者异位子宫内膜间质细胞分泌VEGF,培养48 h后分泌量与在位子宫内膜间质细胞比较差异无统计学意义（P﹥0.05)。1×10-10~1×10-6 mol/L的GnRH-Ⅱ可呈浓度依赖性地抑制体外培养的在位和异位子宫内膜间质细胞分泌VEGF（P<0.01),且对异位子宫内膜间质细胞的抑制作用强于在位（P<0.01)。结论:EMs患者的异位子宫内膜间质细胞分泌VEGF的能力与在位子宫内膜的相近,这对EMs的形成和发展可能起重要作用。GnRH-Ⅱ对EMs患者体外培养的异位子宫内膜间质细胞VEGF的分泌有明显的抑制作用,且作用明显强于对在位内膜间质细胞的。     

子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养及鉴定

目的 探讨子宫腺肌病异位内膜细胞原代培养,为进一步研究子宫腺肌病发病机制提供体外细胞模型. 方法 采用酶解、筛网分离、贴壁法分离异位内膜细胞.采用免疫细胞化学法进行细胞鉴定. 结果 经此法分离培养异位细胞培养成功率可达75.0%,消化得到的异位细胞种类较多,不容易分离提纯,腺细胞占6.5%,间质细胞占13.3%,平滑肌细胞占80.2%. 结论 采用酶解、筛网分离、贴壁法可以获得子宫腺肌病的异位细胞,不能获得纯度较高异位腺细胞,子宫腺肌病异位腺细胞提纯需要进一步探讨.     

活血化瘀中药对大鼠异位子宫内膜细胞增殖的影响

目的 探讨子宫内膜异位症（EMT）模型大鼠异位子宫内膜细胞的增殖特性及活血化瘀中药对其的影响，为临床用药提供实验依据。方法 制备活血化瘀中药含药血清，干预体外原代培养的大鼠异位内膜和在位内膜细胞，应用噻唑蓝（MTT）比色法比较二者增殖率及活血化瘀中药含药血清对其增殖的影响。结果 异位内膜与在位内膜基质细胞的增殖活性相当（P＞0.05）；活血化瘀中药对异位内膜的增殖有显著抑制作用（P＜0.01），而对在位内膜的增殖无明显抑制作用（P＞0.05）。结论 活血化瘀中药含药血清对EMT模型鼠异位内膜的增殖有显著抑制作用而对在位内膜的增殖无明显影响。     

GnRHⅡ与GnRH Ⅰa对子宫内膜异位症患者离体间质细胞增殖抑制的影响

目的:探讨Ⅱ型促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormoneⅡ,GnRHⅡ)与Ⅰ型促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormoneⅠagonist,GnRH Ⅰa)对子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)患者离体培养的子宫内膜间质细胞...     

GnRH II与GnRH I对子宫内膜异位症患者间质细胞 分泌VEGF作用的比较

目的：测定GnRH II与GnRH I对子宫内膜异位症（EMs）患者离体培养子宫内膜间质细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响,探讨GnRH II对EMs患者可能的作用。方法：给予原代培养的EMs患者在位及异位子宫内膜间质细胞不同浓度的GnRH II,GnRH I类似物（戈舍瑞林,goserelin）处理,同时设对照组（不加GnRH）,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养液中VEGF浓度,并进行比较。结果：EMs患者离体培养的异位子宫内膜间质细胞经48 h培养,能分泌VEGF,分泌量与在位子宫内膜间质细胞的相近,两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。不同浓度的GnRH II对EMs患者离体培养的在位和异位子宫内膜间质细胞VEGF的分泌有明显的抑制作用,呈剂量依赖性（P＜0.05）,且较GnRH I类似物（戈舍瑞林）的作用更强（P＜0.05）。不同浓度的GnRH II对EMs患者离体培养的异位子宫内膜间质细胞VEGF分泌的抑制作用明显强于在位（P＜0.05）。结论：EMs患者的异位子宫内膜间质细胞具有分泌VEGF的功能,分泌量与在位子宫内膜的相近,这对EMs的形成和发展可能起重要作用。GnRH II呈剂量依赖性地抑制异位内膜间质细胞分泌VEGF,其抑制作用明显强于在位,且GnRH II明显强于GnRH I,为寻找EMs抗血管形成方面的新药治疗提供了新的依据。     

孕酮对离体在位及异位子宫内膜细胞巨噬细胞移动抑制因子分泌的影响

目的:探讨孕酮对离体在位及异位子宫内膜细胞巨噬细胞移动抑制因子(MIF)分泌的影响。方法:采用 ELISA方法,检测10μmol/L、0.1μmol/L孕酮作用24h后,体外培养的在位及异位子宫内膜细胞上清液中MIF水 平。结果:与空白组比较,高、低浓度孕酮作用24h后的在位及异位子宫内膜细胞MIF分泌量减少;异位内膜组的 下降程度大于在位内膜组(P<0.01);高浓度孕酮作用强于低浓度孕酮组(P<0.05)。结论:孕酮对子宫内膜细胞 分泌MIF具有明显抑制作用,对异位内膜分泌能力的抑制作用更为显著。     

子宫腺肌病原代内膜间质细胞培养及功能学鉴定

目的分离提纯培养子宫腺肌病(AM)内膜间质细胞(ESc),检测其细胞功能的差异,为进一步的细胞及分子水平研究奠定基础。方法选取2013年1月至2016年12月份在本院治疗的正常子宫内膜和子宫腺肌病手术病例,在严格无菌条件下,收集临床确诊的AM患者在位子宫内膜组织12例、异位子宫内膜组织41例及正常对照内膜组织13例,分别分离培养ESc,并通过免疫组织化学法对分离提纯培养的细胞进行鉴定。分别检测三种细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等细胞功能。结果正常人ESc 13例,AM患者在位12例、异位ESc原代分离41例均成功,成功率为100.00%。与正常在位ESc相比,在位、异位ESc在普通光镜下,形态观察无明显差异,但是细胞功能方面,在位ESc生长曲线显示增殖率明显升高;异位ESc的迁移、侵袭率水平升高,差异有统计学意义(P0.01),三种细胞凋亡无明显差异。结论采用间质细胞原代培养方法可以成功培养AM ESc,并保持较高的细胞培养成功率。在位ESc增殖率最高,异位ESc的迁移、侵袭率水平升高,细胞凋亡均无明显差异。