标本因素对HBV DNA测定的影响

目的 探讨脂血、黄疸、溶血及常温储存3d和4℃保存7d对乙肝病毒D N A(H B V D N A)荧光定量测定结果的影响.方法 将阳性标本进行即时检测、室温保存3d检测、4℃保存7d后检测及高脂血和非脂血、黄疸和非黄疸、溶血血清和未溶血血清同时作HBV DNA荧光定量PCR.结果 溶血与未溶血血清标本、黄疸和非黄疸、脂血和非脂血血清标本HBVDNA含量都在同一数量级.血清标本在室温下短期贮存(3d)、4～12保存7d内分别与即时检测HBV DNA含量比较均无统计学意义(P>0.05).结论 脂血、黄疸、溶血、血清标本不同储存温度及时间对HBV DNA定量结果测定无影响.     

脂血标本对HBV DNA定量检测结果的影响

目的:研究脂血对HBV DNA定量检测结果的影响。方法:建立不同浓度的脂血标本,运用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测各种脂血标本HBV DNA数量,进行方差分析。结果:不同浓度脂血标本HBV DNA无显著性差异,F=1.294,P=0.333。结论:脂血对HBV DNA没有影响。说明HBV DNA不需禁食,随时可以检测。     

脂血对检测HBV DNA的影响及解决办法

目的：评价脂血标本对荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA的影响,并选择有效去除脂血对HBV DNA测定干扰的方法。方法：采集29例HBV DNA值〉10^5copies/ml的乙肝青壮年志愿者空腹和高脂饮食后2、46、h静脉血,测定血清甘油三酯（TG）和HBV DNA。选用低温高速离心法和乙醚萃取法处理脂血标本,测定清亮血清HBV DNA值。结果：TG水平轻度升高时,血清HBV DNA测定值有61%超出允许误差范围,且TG水平越高,超出允许误差范围百分率越高、差值越大;TG水平重度升高时,出现假阴性结果。低温高速离心法去除脂血因素干扰效果较萃取法好。结论：高血脂对荧光定量PCR检测HBV DNA结果存在影响,通过低温高速离心法可以有效去除脂血因素干扰。     

标本因素对荧光定量PCR检测HBV DNA的影响

目的: 探讨标本溶血、黄疸、脂血对荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA的影响。方法: 荧光定量PCR检测无溶血、无黄疸、非脂血血清和溶血、黄疸、高脂血清标本的HBV DNA。结果: 溶血、黄疸、高脂血血清与无溶血、无黄疸、非脂血血清HBV DNA定量检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论: 标本溶血、黄疸、脂血对荧光定量PCR检测HBV DNA无干扰。     

Sybr greenⅠ实时定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的探讨

目的　选择以SybrgreenⅠ作为荧光指示剂做实时PCR (SYBR法 ) ,检测乙肝病毒 (hepatitisBvirus ,HBV )DNA ,并与国产TaqMan荧光实时定量PCR方法比较。 方法　对 189例临床血清标本DNA分别进行常规PCR和SybrgreenⅠ荧光PCR检测。 结果　使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法测得 10 6例HBVDNA阳性 ,67例阴性 ,16例判断困难。使用SybrgreenⅠ实时定量PCR方法测得 117例HBVDNA阳性 ,72例阴性 ,使用SybrgreenⅠ实时定量PCR方法测得HBVDNA阳性熔解曲线Tm值为 83 .67± 0 .95℃。其中 10 6例阳性和 67例阴性与使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法所测阴阳性一致 ,二者定量的回归系数为 0 .941。使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法判断困难的 16例中 ,11例SybrgreenⅠ实时定量PCR方法判断为阳性 ,但定量拷贝数很低 ,其中最大值为 1.68× 10 3 拷贝/ml,最小值为 4.3 7× 10 2 拷贝 /ml ,平均值为 83 9拷贝 /ml ;另 5例判断为阴性。结论　使用SybrgreenⅠ荧光素进行实时定量PCR检测HBVDNA的敏感度要高于国产TaqMan的荧光实时定量PCR方法 ,能够适合目前临床上及时有效准确检测标本的要求。     

D-二聚体检测失败的解决方法

目的通过对D-二聚体反应曲线的观察与分析,探讨各种不同情况下的D-二聚体检测失败的解决方法。方法对于检测失败的标本,认真分析反应曲线,同时结合标本的外观属性,采取相应的解决方法。结果①当D-二聚体浓度低于检测下限时,直接报"小于低限值";②当反应曲线基线吸光度偏高时,机外手工3倍稀释复测,有个别标本仍检测失败,增大至10倍稀释,复测成功,验证为超出检测上限的极高值脂血标本;③当反应曲线起始斜率超限时,机外手工进行5倍稀释再以DD(D)模式复测,仍有1标本复测失败,属于极高值标本,经10倍稀释后复测成功。结论 D-二聚体低于仪器的检测低限,或高于检测高限时均直接导致检测失败;而重度脂血、重度黄疸血则会显著抬高本底,影响光度计的分辨能力,也可能导致检测失败。应仔细解读反应曲线,具体情况具体分析,方能给出恰当的解决方法。     

血红蛋白和肝素对FQ-PCR检测HBV DNA结果的影响

目的探讨血红蛋白和肝素对荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）定量检测乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）的影响。方法采用沉淀煮沸裂解法提取含不同浓度血红蛋白或肝素的血浆标本中的HBVDNA,应用FQ-PCR方法对HBVDNA进行定量检测。结果血浆标本中血红蛋白浓度〈37g/L或肝素浓度〈62.5U/ml时,对HBVDNA的定量结果无明显影响,但当肝素浓度达到125U/ml以上时,PCR反应明显受到抑制。结论对轻微的溶血和使用常规浓度肝素抗凝的血浆标本,可采用沉淀煮沸裂解法提取HBVDNA进行FQ-PCR定量检测。     

实时定量聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3方法的建立

目的 建立检测前列腺癌抗原3(PCA3)基因的实时定量聚合酶链反应(PCR)方法.方法 应用反转录-PCR扩增PCA3后,通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定.应用SYBR Green实时荧光定量PCR检测PCA3和建立相应的标准曲线,使用熔解曲线分析扩增产物的特异性.同时在临床标本中验证所建立的PCA3检测方法的效能...     

实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达

[摘　要]　目的 构建检测急性髓细胞白血病FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方法，为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计出扩增FLT3基因的引物和特异性荧光探针。提取K562细胞株总RNA，经RT-PCR 扩增，产物纯化后与pUCm-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒FLT3P。 建立荧光定量PCR 检测 FLT3基因技术方法，建立标准曲线并检测15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR 扩增出现强烈的荧光值增长，表明FLT3 cDNA已成功克隆。以109～105copies/μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR 扩增, 所获得的Ct 值与标准品浓度的对数存在良好线性关系, 标准曲线回归系数为0.9998 。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常对照组（p=0.017）， 且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测FLT3 mRNA表达得荧光定量PCR的标准品和技术方法; AML病例 FLT3表达水平显著增高。     

FQ-PCR两种定量检测乙型肝炎病毒DNA方法分析比较

目的:观察荧光定量聚合酶链反应(FQ- PCR)两种定量检测乙型肝炎病毒DNA方法的重复性、准确性。方法:采用终点法与实时荧光分析法分别定量检测2 4份阳性标本,其中6份为经10倍稀释的阳性标本,连续3d测定,另18份为弱阳性临床标本,9份阴性标本,共33份。两种方法对同一扩增管中反应体系的荧光值进行测定,终点法只检测扩增管扩增前后的荧光值,实时荧光分析法则检测扩增管每一次循环的荧光值,然后分别由相应的软件自动计算结果,再对结果进行比较分析。结果:终点法的批内变异系数较实时荧光分析法稍大,在中、低浓度区两种方法测定值基本在同一指数水平,在高浓度区前者低于后者2个对数倍,在较低浓度区则不及后者敏感。结论:实时荧光分析法较终点法敏感、结果的重复性更好,检测范围宽,更能反映体内病原体的真实浓度     

乙型肝炎血清学标志物与HBV-DNA含量关系的探讨

目的:为了进一步探讨乙型肝炎患者血清中HBV-DNA含量与HBV血清学标志物之间的关系,了解荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒的应用价值。方法:应用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测510例来自我院门诊就诊者和住院患者血清标本中的特异性抗原抗体,并同时应用荧光定量PCR分析系统测定血清标本中HBV-DNA的含量进行分析。结果:经ELISA法与FQ-PCR法检测的510例血清标本中,51例"大三阳"(HBsAg+HBeAg+HBcAb)的血清标本,其HBV-DNA检出数均呈阳性,阳性率为100%,其HBV-DNA的拷贝数范围为105~109/ml;76例"小三阳"(HBsAg+HBeAb+HBcAb)的血清标本,其HBV-DNA检出的阳性率为47.4%,HBV-DNA的拷贝数范围为104~107/ml。结论:HBV-DNA是乙型肝炎病毒感染和复制的特异性指标,应用FQ-PCR技术检测乙型肝炎病毒,具有较高的灵敏度和特异性,其操作简便,定量准确,结果可靠,它比HBV血清学标志物更能反映乙型肝炎病毒在体内的存在和真实复制状况,在HBV-DNA感染诊断,特别是药物疗效的观察中,具有良好的应用价值。因此,HBV-DNA与血清学标志物的相互关系是本文研究的课题。     

外周血乙型肝炎病毒核酸水平与丙氨酸氨基转移酶关系的探讨

目的　探讨血清中乙型肝炎病毒核酸 (HepatitisBvirus -DNA ,HBV -DNA)含量与丙氨酸氨基转移酶 (Alanineaminotransferase ,ALT)的关系。方法　用荧光实时定量聚合酶链反应 (Fluorescencereal-timequantita tivepolymerasechainreaction ,FQ -PCR)和连续监测法分别检测了 5 2 8例乙型肝炎病毒感染者及非病毒感染者血清中HBV -DNA和ALT水平。结果　当血清中HBV -DNA含量在 10 6拷贝 /毫升以下时 ,随着血清中HBV -DNA含量的增加 ,血清ALT水平升高 ;但当HBV -DNA含量超过 10 6拷贝 /毫升后 ,ALT水平反而随着血清中病毒数量的增加而呈减弱趋势。结论　血清中乙型肝炎病毒数量与ALT之间存在一定的关系 ,但不能只依据血清ALT水平来推断乙型肝炎病毒在体内的复制活跃程度     

国产荧光定量PCR与COBAS Amplicor检测HBV DNA的结果比较

目的比较国产实时荧光定量PCR（FQ PCR）试剂与罗氏COBAS Amplicor方法检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA的结果。方法据COBAS Amplicor 的FQ PCR试剂（A）的检测结果,抽取151份慢性乙型肝炎（慢乙肝）血清标本,采用两种国产实时FQ PCR试剂B、C对血清标本进行HBV DNA平行检测,以分析国产试剂的敏感度、特异度及与试剂A的相关性。结果试剂A、B、C测得的HBV DNA结果分别为（5.87±1.64）、（5.11±1.34）、（4.93±1.35）log10?copies/mL,试剂B、C与试剂A的相关系数分别为0.947、0.937。3种试剂检测结果总体差异有统计学意义（P＜0.05）,试剂B、C与试剂A检测结果相比差异有统计学意义（P＜0.05）。低HBV载量标本,试剂B、C与试剂A相关性较低。以试剂A为准,总体灵敏度、特异度分别为试剂B 90.4％、56.3%,试剂C 77.0%、100%。结论试剂B、C与试剂A在检测HBV DNA方面有较好一致性,但在低HBV载量时可靠性较低。试剂B灵敏度高,试剂C特异度高。     

乙型肝炎病毒核酸定量检测中不确定度的研究

目的研究应用实时荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR）开展乙型肝炎病毒（Hepatitis Bvirus,HBV）核酸定量检测中的测量不确定度。方法通过实时荧光定量PCR进行乙型肝炎病毒核酸定量检测的实验分组设计与数据处理分析,计算分析该检测方法不同来源的测量不确定度值。结果对3组不同水平浓度值样本来源的数据采用两种方法进行统计分析,QDNA的组标准差远远大于LGQDNA的标准差,初始浓度数值经过对数转化后离散程度降低,统计平均值也发生了偏离。LGQDNA为3.465、4.927和6.018的样本,其浓缩过程来源的相对不确定度分别为0.020、0.019和0.009;LGQ无偏估计在3.706、6.750的样本的核酸提取来源相对不确定度分别为0.016和0.009;数据分析来源的LGQ不确定度为0.000～0.008;热循环仪来源的LGQ不确定度为0.002～0.008。结论使用核酸浓度值QDNA与使用其对数值LGQDNA进行数据统计分析的结果存在差异;标本制备过程中的浓缩和DNA提取是实时荧光定量PCR进行HBV核酸定量检测时测量不确定度的重要来源,标本制备环节是影响该项检测的关键因素,包括试剂、方法和操作者的准确操作能力。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎的临床研究

目的:探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测乙型肝炎的临床价值。方法:应用FQ-PCR技术对1562例乙型肝炎阳性血清标本和无症状健康者血清进行HBV-DNA检测并对不同血清型的HBV-DNA进行比较。结果:经FQ-PCR检测,380例HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率100%;246例HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率88.6%;210例HBsAg(+)、HBeAg(+)其HBV-DNA阳性率98.1%;190例HBsAg(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率69.5%;146例HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率22.6%;66例HBsAb(+)其HBV-DNA阳性率6.1%;20例HBsAb(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率60.0%;18例HBsAb(+)、HBeAb(+)其HBV-DNA阳性率55.5%;286例“两对半”五项全阴性的病例中有4例HBV-DNA阳性,其阳性率为1.4%。结论:血清中HBV-DNA水平反映了体内HBV是否复制及复制的程度,定量PCR是鉴别HBV感染各期有价值的工具,是评价传染性的可靠方法。定量PCR测定灵敏度高,对乙型肝炎的临床诊断、治疗方案的选择和疗效观察有重要意义。     

乙型肝炎病毒感染者血清HBV-DNA载量测定的临床意义

目的:探讨HBV-DNA载量测定的临床意义及其与HBV-M、拉米夫定治疗的相关性。方法:采用酶联免疫吸附试验和荧光定量聚合酶链反应技术对280例乙肝患者HBV-M和HBV-DNA载量进行检测;同时动态检测32例乙肝患者48周拉米夫定治疗期间血清HBV-M和HBV-DNA载量变化。结果:HBeAg(+)组患者血清HBV-DNA载量显著高于HBeAg(-)组(P<0.01);不同临床类型急性肝炎组HBV-DNA载量与其它组比较(P<0.05);其它各组HBV-DNA载量之间比较(P>0.05);拉米夫定治疗12周、24周、48周后HBV-DNA载量迅速下降,与治疗前比较(P<0.001);HBV-DNA载量下降明显较HBeAg血清学转换发生早。结论:HBeAg是反映HBV-DNA复制的重要指标;HBV-DNA载量测定是反映HBV复制和判断药物疗效的最直接、可靠的指标。     

干扰素治疗慢性乙型肝炎病人HBV-DNA的实时FQ-PCR检测及其意义

①目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）定量检测乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）对干扰素（IFN）治疗慢性乙型肝炎（CHB）疗效预测及评价的价值。②方法 21例CHB病人，在治疗前、治疗过程中第1～6个月、疗程结束后随访6和12个月共9个时间点分别取血，用FQ-PCR定量检测HBV-DNA、放免法定量检测HBeAg。③结果 用药后第1～5个月，HBV-DNA载量逐月下降（H=137．50，q=4．68～14．04，P均〈0．01）;其后不再下降。治疗前血清HBV-DNA与HBeAg和谷丙转氨酶（ALT）呈高度正相关（r=0．719、0．492，P〈0．05），治疗期间及随访过程中各时间点HBV-DNA与ALT呈负相关（r=-0．259～-0．057，P〈0．05），与HBeAg呈低度正相关（r=0．014～O．138，P％0．05）。④结论 FQ-PCR以其高度的敏感性及简便、快速、准确而成为目前HBV-DNA定量检测的首选方法；在应用IFN治疗CHB前，应根据血清HBV-DNA拷贝数和其他预测因子慎重选择病例，可以明显提高疗效。     

乙肝病毒血清标志物模型与HBV—DNA定量的相关性

目的：探讨乙肝病毒血清标志物模型与HBV-DNA定量的相关性。方法：应用酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光定量聚合酶链反应技术（FQ-PCR）,对865例乙型肝炎病毒携带者血清标本分别进行乙肝病毒血清标志物模型与HBV．DNA定量测定。结果：模式A（大三阳）的检出率最高,为96．1％,模式B（小三阳）的HBV—DNA检出率为79．0％,模式CHBV-DNA检出率为63．5％。结论：HbeAg是反映HBV复制活跃的可靠指标;血清HBeAg阴性,病毒并未停止复制;联合检测乙肝标志物和HBV-DNA水平有助于疾病的诊断、疗效提高及预后判断。     

HBsAg阳性产妇血清及乳汁HBV-DNA定量分析及应用

目的 为选择方便、准确的方法定量检测产妇血清及乳汁HBV-DNA的含量,依据两项检测结果特别是乳汁中乙型肝炎病毒载量,指导母乳喂养.方法 选择HBsAg阳性的产妇232例,采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测产妇血清及乳汁HBV-DNA的含量.结果 232例血清HBsAg阳性产妇血清HBV-DNA阳性177例,据血清HBV-DNA的含量,分≥105 copy/ml和＜105 copy/ml两组,两组乳汁HBV-DNA阳性符合率分别为为54.4%和14.9%,两组比较差异有统计学意义（P＆lt;0.01）.血清HBV-DNA阴性者乳汁HBV-DNA均阴性,血清HBV-DNA阳性者乳汁HBV-DNA总阳性符合率为37.9%.结论 血清HBV-DNA定量检测阳性的产妇其乳汁中HBV-DNA检测阳性的占较大比例,且乳汁中HBV-DNA含量与血清病毒含量成正比.检测HBV感染产妇乳汁中HBV-DNA含量,对阻断母婴传播,为HBV感染产妇选择是否母乳喂养提供了指导依据.     

HBV-DNA与其病毒免疫标志物的关系

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染者HBV-DNA与病毒免疫标志物的关系。方法:采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对568份HBV感染者血清中HBV-DNA含量进行检测,同时用ELISA法检测其HBV免疫标志物。结果:HBsAg、HBeAg和HBcAb阳性组HBV-DNA阳性率约为98.9%;HBsAg、HBcAb和HBeAb阳性组HBV-DNA阳性率约为65.4%;HBsAb、HBcAb和HBeAb阳性组HBV-DNA阳性率约为13.9%;三组间HBV-DNA阳性率有明显差异(P<0.01)。HBeAg阳性标本中HBV-DNA阳性率最高,达92.0%;HBsAg与HBV-DNA的符合率最高,为77.6%。结论:检测HBV-DNA含量结合血清病毒标志物对乙型肝炎的临床诊断治疗以及病情判断有重要意义。