氧张力对培养的血管内皮细胞内超氧化物歧化酶活性的影响

目的：研究氧张力对培养的人脐静脉血管内皮细胞（VEC）内超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响，探讨缺血再灌注损伤的机理。方法：用胶原酶消化法获取VEC，在不同氧张力下培养8天，检测其SOD活性。结果：在高氧张力下培养的VEC其SOD活性比在低氧张力下培养的高（P＜0．01）。结论：氧张力对培养的VEC内SOD活性有调节作用。     

小檗碱逆转高糖对血管内皮细胞迁移的抑制作用

目的：观察小檗碱对高糖条件下血管内皮细胞迁移的影响,并研究可能的作用机制。方法以体外培养的EA．hy926人脐静脉血管内皮细胞为模型,采用划痕试验的方法研究高糖及不同浓度条件下对内皮细胞迁移的影响;采用电泳迁移率变动分析法检测核因子-κB（NF-κB）的DNA结合活性。结果33mmol/L浓度的葡萄糖可抑制内皮细胞的迁移;小檗碱可逆转高糖对内皮细胞迁移的抑制作用。作用机制的研究表明,高糖可诱导NF-κBDNA结合活性上调,而采用小檗碱处理后可降低NF-κB活性。结论小檗碱可逆转高糖对内皮细胞迁移的抑制作用,该作用可能涉及抑制NF-κB的DNA结合活性上调。     

氯沙坦对高糖状态下内皮细胞的保护作用及其机制探讨

目的：探讨高糖环境下氯沙坦对内皮细胞的保护作用及其机制。方珐：比色法测定内皮细胞条件培养上清中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性和丙二醛（MDA）水平，RT—PCR方法分析细胞yEGFmRNA的表达水平，ELISA方法检测细胞分泌的VEGF蛋白。结果：在高糖处理的细胞条件培养上清中SOD和CAT活性降低，而MDA含量升高（P〈0．05），同时细胞yEGF mRNA和蛋白质表达增加（P〈0．05）；而氯沙坦可削弱上述变化，降低内皮细胞MDA含量、增强SOD与CAT活性，以及下调VEGF mRNA和蛋白质表达（P〈0．05）。结论：高糖可诱导内皮细胞活性氧产生增多，抗氧化酶活性下降，导致细胞氧化平衡失调，使yEGF mRNA表达与蛋白分泌增加，促进高糖时内皮细胞病变的进展，提示氯沙坦对高糖状态下的内皮细胞的保护作用可能与调节内皮细胞氧化平衡和抑制内皮细胞的活化有关。     

益生注射液对人内皮细胞缺氧再给氧损伤的拮抗机理研究

目的　探讨内皮细胞缺血再灌注损伤及中药益生注射液对其的拮抗机理。方法　用无糖培养基在无氧条件下培养使人脐静脉内皮细胞株 ECV30 4缺氧 1.5小时 ,然后以含糖培养基 ,在 5 % CO2 和 37℃条件下给氧培养 5小时 ,建立内皮细胞缺氧再给氧模型 ,以模拟体内缺血再灌注对血管内皮细胞的损伤 ,并用益生注射液干预其缺氧再给氧过程 ,荧光染色显示胞内钙离子与线粒体 ,细胞化学染色显示胞内琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (L DH)活性 ,并检测细胞培养液中超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)和一氧化氮 (NO)浓度。结果　缺氧再给氧使 ECV30 4细胞变圆、收缩、脱落 ,细胞内钙离子含量增高 ,线粒体膜电位减弱 ,SDH活性下降 ,L DH活性增高 ,培养液中 SOD与 NO含量减少 ,而 MDA浓度增高 ;用益生注射液干预后 ,ECV30 4细胞形态基本恢复正常 ,上述多项检测指标的改变得以逆转。结论　缺氧再给氧导致 ECV30 4细胞发生脂质过氧化 ,胞内钙离子超载、SOD活性及 NO水平降低、线粒体功能受损 ,益生注射液可使上述变化得以逆转 ,从而拮抗内皮细胞缺氧再给氧损伤     

益生注射液对人内皮细胞缺氧再给氧损伤的拮抗机理研究

目的 探讨内皮细胞缺血再灌注损伤及中药益生注射液对其的拮抗机理。方法 用无糖培养基在无氧条件下培养使人脐静脉内皮细胞株ECV304缺氧1.5小时，然后以含糖培养基，在5%CO2和37℃条件下给氧培养5小时，建立内皮细胞缺氧再给氧模型，以模拟体内缺血再灌注对血管内皮细胞的损伤，并用益生注射液干预其缺氧再给氧过程，荧光染色显示胞内钙离子与线粒体，细胞化学染色显示胞内琥珀酸脱氢酶（SDH）和乳酸脱氢酶（LDH）活性，并检测细胞培养液中超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）浓度。结果 缺氧再给氧使ECV304细胞变圆，收缩、脱落，细胞内钙离子含量增高，线粒体膜电位减弱，SDH活性下降，LDH活性增高，培养液中SOD与NO含量减少，而MDA浓度增高；用益生注射液干预后，ECV304细胞形态基本恢复正常，上述多项检测指标的改变得以逆转。结论 缺氧再给氧导致ECV304细胞发生脂质过氧化，胞内钙离子超载，SOD活性及NO水平降低，线粒体功能受损，益生注射液可使上述变化得意以逆转，从而拮抗内皮细胞缺氧再给氧损伤。     

11,12-环氧二十碳三烯酸对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的通过观察11,12-环氧二十碳三烯酸(11,12-EET)对缺氧/复氧人脐静脉内皮细胞损伤程度的影响,了解EET血管保护的可能途径,并初步探讨其作用机制。方法采用原代培养人脐静脉内皮细胞,随机分为对照组、缺氧/复氧组、11,12-EET对照组、11,12-EET缺氧/复氧组、细胞外信号调节的蛋白激酶(ERK1/2)抑制组和一氧化氮合酶抑制组。通过向培养瓶内通入混合气体(2%O2,5%CO2,93%N2)3h,复氧1h复制缺氧/复氧损伤模型。采用MTT法检测细胞存活率,比色法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的变化,Westernblot方法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和ERK1/2的表达。结果11,12-EET在常氧条件下可对细胞造成轻度损伤,而在缺氧/复氧条件下能显著提高内皮细胞的存活率,降低LDH的漏出率,提高SOD的活性,降低MDA的含量,并且促进eNOS、磷酸化ERK1/2的表达。结论11,12-EET具有拮抗内皮细胞缺氧/复氧损伤作用,这与其提高缺氧/复氧内皮细胞SOD活性、清除氧自由基、减少缺氧/复氧对eNOS及磷酸化ERK1/2表达的抑制有关。     

人脐静脉内皮细胞的体外培养及微重力对其增殖的影响

目的探讨微重力环境对人脐静脉血管内皮细胞增殖的作用。方法取健康产妇剖宫产术后脐带，用胶原酶Ⅰ消化血管内皮细胞，进行原代培养，在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作用下细胞长期传代；将内皮细胞置于回转器内模拟太空微重力培养，同时设地面静止培养对照，测定72h内血管内皮细胞增殖水平。结果模拟微重力下细胞增殖高于对照组。结论培养的脐静脉血管内皮细胞对微重力环境敏感。     

人脐静脉内皮细胞的体外培养及鉴定

目的：探讨人血管内皮细胞体外培养方法,为研究心脑血管疾病发病机制提供实验手段。方法：采用0．1％胶原酶消化、分离体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0．125％胰酶-0．01％EDTA 溶液消化传代。并用光镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后约4h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论：用胶原酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高,为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

人脐静脉内皮细胞培养方法的改进及其优势

目的：改进血管内皮细胞培养方法。方法：用胰酶消化、分离脐静脉内皮细胞，用含20%人AB血清的RPMI 1640完全培养液，于37℃、5%CO2条件下培养细胞，以1:2传代。以传统的20%胎牛血清+基础培养液培养方法（对照组1）和20%胎牛血清+生长因子+基础培养液培养方法（对照组2）作为对照，比较三种方法对细胞活力、培养细胞数量、实验费用等方面的影响。结果：以改良方法培养的脐静脉内皮细胞，呈典型内皮细胞外观，特征性地表达内皮细胞标志，与对照组相比，改良法培养的细胞数量和细胞活力明显优于对照组1，所需实验费用明显少于其它两组。结论：以改良法培养血管内皮细胞，更加简便、经济、可收获大量细胞，可满足大规模内皮细胞实验研究。     

人脐静脉内皮细胞的体外培养,鉴定及形态观察

目的：建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞重要的实验手段。方法：Ｅ和０．２５％的胰蛋白酶静脐内皮细胞，种植在培养板中，观察其生长情况，且用间接酶免法及电下进行内皮细胞鉴定。结果：种植在培养板中的内皮细胞４ｈ开始贴壁生长，。４８￣７２ｈ生长最快，７￣１０ｄ呈多角形。内皮细胞胞浆中有ＶＷＦ相关抗原和电镜下可见胞浆中有Ｗ－Ｐ步体外可确定培养的细胞为血管内皮细胞，结论：有胰酶灌注脐静脉消化内皮     

黄芪黄酮改善同型半胱氨酸诱导内皮功能紊乱的研究

目的：观察黄芪黄酮对同型半胱氨酸（Hcy）介导的内皮功能紊乱的作用,并进一步探讨其具体机制。方法采用离体血管灌流技术,观察离体血管舒张功能变化;采用离体培养人脐静脉内皮细胞培养技术,测定内皮细胞产生的超氧阴离子和一氧化氮（NO）含量,以及一氧化氮合酶（NOS）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 Hcy（10-3mol/L）可显著抑制乙酰胆碱（Ach）介导的内皮依赖性血管舒张功能[舒张幅度为：（66.26±3.71）%],黄芪黄酮（10-2,10-1,1,10g/L）则呈浓度依赖性地改善Hcy（10-3mol/L）所致的内皮依赖性血管舒张功能损伤[（66.71±7.29）％,（74.67±6.64）%,（81.73±5.92）%,（85.94±5.85）%,均P＜0.01],其作用与SOD类似,而NOS抑制剂Nω-硝基左旋精氨酸甲酯盐酸盐（L- NAME）可以阻断黄芪黄酮的作用。进一步细胞实验证实Hcy显著抑制内皮细胞NO产生[（7.53±1.31）vs（16.61±1.52）×10-6mol/g,P＜0.01],抑制NOS[（3.28±0.24）vs（8.35±0.37）kU/g,P＜0.01]和SOD活性[（8.69±1.54）vs（14.74±1.57）kU/g,P＜0.01]、以及诱导超氧阴离子的生成[（179.14±14.82）％vs（100.00±8.95）％, P＜0.01];而黄芪黄酮（1g/L）和SOD均可逆转Hcy对内皮的损伤作用（均P＜0.01）。结论本研究证实黄芪黄酮通过其抗氧化作用改善同型半胱氨酸损伤的NOS-NO途径,从而具备血管内皮的保护功能。     

重组血管基膜衍生多功能肽对内皮细胞信号蛋白磷酸化水平的影响

目的:研究重组血管基膜衍生多功能肽(rVMBDMP)对人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)信号蛋白磷酸化水平的影响。方法:体外培养HUVE-12细胞,C57/BL6小鼠皮下基质胶填塞法观察HUVE-12细胞体内管状结构形成;高通量蛋白磷酸化芯片研究rVBMDMP对HUVE-12细胞信号蛋白磷酸化水平改变。结果:C57/BL6小鼠皮下基质胶填塞法证实:rVBMDMP(1.0,10.0μmol/L)能有效抑制血管内皮生长因子激活的内皮细胞体内管状结构形成。蛋白磷酸化芯片检测结果显示:rVBM-DMP(1.0μmol/L)处理HUVE-12细胞后,死亡信号蛋白(caspase-3,death receptor 3,4,5)和整合素亚单位(integrinαv,β1,β3)磷酸化蛋白较对照组增高2倍以上,而EGFR,pEGFR,VEGFR-1和Survivin磷酸化蛋白较对照组降低50%以下。结论:rVBMDMP可能通过抑制血管内皮生长因子激活的内皮细胞生长和诱导凋亡发挥抗血管生成效应。     

低氧对人脐带间充质干细胞活性和内皮分化能力的影响及VEGF的干预作用

目的: 探讨低氧对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的活性及向内皮细胞分化能力的影响,并进一步探索外源性VEGF对低氧损伤的保护作用。方法: 在体外对hUC-MSCs进行分离培养。对hUC-MSCs的形态学和表型特征进行分析。在添加/不添加50 ng/mL VEGF的情况下,对hUC-MSCs分别进行不同时间的低氧诱导后,对细胞凋亡率、ROS生成及细胞增殖能力进行检测,并对hUC-MSCs的内皮分化能力进行评估。结果: 低氧诱导早期(6, 12 h),hUC-MSCs的凋亡及ROS生成显著增加,增殖能力显著下降;晚期(24,72 h),细胞的增殖及凋亡水平与对照组间无明显差异;高浓度(50 ng/mL)外源性VEGF抑制低氧诱导早期出现的凋亡增加及增殖下降;外源性VEGF存在的情况下,低氧诱导14 d,hUC-MSCs表达早期内皮细胞表型,并能获得部分内皮细胞功能。结论: 低氧早期造成hUC-MSCs急性损伤,晚期通过逐步适应恢复细胞活性并保持了其分化潜能。VEGF能够保护急性缺氧对细胞的损伤,并能诱导其向内皮样细胞分化。     

妊高征患者血浆致内皮细胞eNOS mRNA表达增强的研究

目的　研究妊高征 (PIH)患者的血浆对体外培养的内皮细胞合成一氧化氮 (NO)及内皮型一氧化氮合成酶 (eNOSmRNA)表达的影响 ,探讨PIH患者血中NO水平的改变及改变的原因。　方法　在体外培养的脐静脉内皮细胞中分别加入PIH患者和正常晚孕妇女的血浆 ,2 4h后应用Northern杂交法比较加入不同血浆的内皮细胞eNOSmRNA表达的差异。　结果　加入PIH组血浆的内皮细胞eNOSmRNA的表达水平较加入正常晚孕组的内皮细胞的eNOSmRNA的表达水平增高 (P <0 .0 1)。　结论　eNOSmRNA表达增强可能是PIH时的一种代偿机制。     

人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术

目的 研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术，探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性。方法 新鲜脐带42条，脐静脉内灌注消化酶消化，获得内皮细胞：以含20％的胎牛血清M199液进行培养。采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度：内皮细胞加入含10％DMSO冷冻保存液，置于液氮进行保存，复苏后进行锥虫蓝试验，四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在95％以上。复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异。冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高，但无统计学意义。结论 脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力，可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源。     

The Active Metabolite of Leflunomide A771726 Inhibits Corneal Neovascularization

The effects of A771726, the active metabolite of leflunomide, on experimental rat corneal neovascularization （NV） in vivo and on cultured human umbilical vein endothelial cells in vitro were studied. The corneal NV was induced by alkali burn in 40 SD rats. The rats were randomly divided into 4 groups with 10 rats in each group. Group A was treated with 0.9% sodium chloride （control group）, and group B, group C and group D were given different concentrations of A771726 eye drops （0.5%, 1.0%, 2.0% respectively） 4 times daily during days 0--28. The occurrence and development of corneal NV were observed at 4, 7, 14, 21 and 28 day after alkali burn by a slit lamp microscope. The cultured human umbilical vein endothelial cells （ECV-304） were incubated with A771726 solution at different concentrations （20, 40, 80, 160, 320 μmol/L） for 36 h. The proliferation of cells was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）, and the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） in cells was detected by using immunofluorescence under the laser confocal microscope. The rat model showed that the onset of corneal NV was delayed and progression of corneal NV was inhibited in the groups C and D. The corneal NV areas in groups C and D were significantly smaller than in groups A and B （P〈0.01）. No significant difference was found in corneal NV areas between groups C and group D （P〉0.05）. A771726 solution （940 μmol/L） could inhibit proliferation of human umbilical vein endothelial cells and decrease the expression of PCNA in cells significantly, A771726, as the active metabolite of leflunomide, strongly prevented corneal NV induced by alkali burn in the in vivo model, and inhibited proliferation of human umbilical vein endothelial cells in the in vitro model. Therefore, A771726 may serve as an angiogenic inhibitor in the treatment of corneal NV.     

不同压力下人脐带静脉的形态变化

运用扫描电镜和光镜观察了人脐带静脉的形态结构及其在0～8.0kPa 压力下的变化.脐静脉结构类似中等动脉.内皮细胞和内弹力膜的形态随实验压力增大而改变.6.7～7.3kPa是脐静脉内膜的临界破坏压,5.3～6.7kPa 是制备脐静脉作为管道移植材料的最佳压力.     

人内皮抑素基因转染原代成人黑色素瘤细胞

目的:研究人内皮抑素（human endostatin,hEndo）基因转染的原代黑色素瘤细胞的体外和体内生物学特性。方法:先构建重组人内皮抑素的真核表达载体pcDNA3.1-hEndo,将人内皮抑素基因导入原代成人黑色素瘤细胞,检测转基因细胞hEndo蛋白的表达、分泌和抑制细胞增殖活性,并验证转基因细胞在体外和裸鼠体内的生长特性。结果:载体pcDNA3.1-hEndo经酶切后获得5.4kb和624bp条带,电转后G418筛选获得克隆;RT-PCR检测到转染细胞表达hEndo mRNA,Western blot检测到转染细胞分泌hEndo蛋白,MTT表明转基因细胞上清可抑制细胞增殖;裸鼠体内生长实验显示转基因黑色素瘤生长速度明显低于对照组（P<0.05）,肿瘤组织RT-PCR示hEndo基因稳定表达。结论:转hEndo基因原代黑色素瘤细胞可有效、稳定地表达有生物学活性的hEndo,hEndo能抑制瘤细胞在动物体内的生长速度。