同种异体胰岛细胞移植在糖尿病小鼠中的实验研究

目的 通过建立糖尿病小鼠模型,观察同种小鼠胰岛细胞移植前后血糖、胰岛功能的变化,探索胰岛细胞分离、纯化、移植的方法及有效性.方法 采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)复制糖尿病小鼠模型,经胆囊注入V型胶原酶水浴消化胰腺并进行密度梯度离心以分离纯化胰岛细胞,并在消化液和Ficoll分离液中加入了大豆胰酶抑制剂(STI)和牛血清白蛋白组份V(BSA),用双硫腙(DTZ)法判定胰岛纯度,锥虫蓝排斥试验评估胰岛存活率;糖尿病小鼠行同种异体胰岛细胞移植后,检测受体血糖、胰岛素及C肽变化,以判定胰岛功能.结果 糖尿病小鼠模型胰腺形态有明显病理变化,同种小鼠胰岛纯化后细胞形态完好,使分离纯化后的胰岛产量由原来方法的(40.7±13.2)个提高到了(263.5±32.I)个(P<0.01),活性在95%以上,胰岛移植后,实验组48 h后血糖明显下降,C肽水平上升.结论 采用加用STI、BSA小鼠胰岛细胞分离纯化方法可增加胰岛细胞产量,同种小鼠胰岛细胞移植能明显降低糖尿病小鼠血糖水平,改善胰岛功能,从而达到治疗目的 .     

小鼠胰岛细胞分离纯化后门静脉注射肝内移植模型的建立

目的建立高效。高纯度小鼠胰岛细胞分离纯化，经小鼠门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内移植方法。方法动物手术放大镜下，采用小鼠胆总管内灌注胶原酶方法消化，非连续梯度离心液离心，纯化胰岛，立体显微镜下用将胰腺外分泌组织、腺泡、淋巴结、导管组织吸走，胰岛计数后门静脉注射移植到同种异体受体小鼠肝内。结果胰岛分离时间约180min，纯化后每只小鼠可获200个胰岛。同系胰岛移植后1～2d，糖尿病小鼠血糖下降至11．1mmol／L以下。结论小鼠胰腺采用胆总管灌注胶原酶方法消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性，采用门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内可明显降低糖尿病小鼠血糖值，这一模型的建立可为今后进行人胰岛小鼠移植提供有价值的实验依据。     

应用淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的实验研究

目的：建立一种简便、易行和高效的胰岛分离纯化方法，以减少对胰岛细胞的损伤，获得高质量的胰岛组织。方法：选用SD大鼠经胆总管原位灌注胶原酶液，分离消化胰腺组织，用淋巴细胞分离液(histopaque-1077)纯化胰岛细胞。结果：可收获大量的高纯度胰岛，纯度达95％以上，体外葡萄糖刺激实验表明胰岛对刺激反应良好，将胰岛移植于糖尿病小鼠体内可短期纠正其高血糖状态。结论：应用单一密度淋巴细胞分离液纯化大鼠胰岛的方法是一种操作简单、价格低廉、重复性好的大鼠胰岛纯化方法。     

人胰岛的分离纯化和功能评价

目的 应用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化人的胰岛,并进行功能和安全性的评价.方法 获得6例成人尸体胰腺组织供体,采用胶原酶消化法及密度梯度离心法分离和纯化胰岛,并分析胰岛的数量、纯度和活力.采用免疫荧光法分析胰岛内分泌细胞的组成和分布;检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛移植后的动物血糖水平.并对分离胰岛的安全性指标进行评价.结果 分离纯化后的胰岛数量为(22.9±3.1)万IEQ,纯度为(59.0 ±8.9)%,活力为(89.0±3.0)%.免疫荧光显示,胰岛由4种内分泌细胞组成并呈正常分布.葡萄糖刺激胰岛素释放的刺激指数为8.1 ±4.0.胰岛移植于糖尿病裸鼠后,血糖在3 d后降至正常水平并维持超过30 d.分离胰岛样本的各项安全性指标在规定范围之内.结论 采用Ricordi人胰岛分离技术分离和纯化的胰岛在形态、结构、数量、纯度、活力、体内外功能以及安全性方面都达到临床胰岛移植的标准,为开展临床胰岛移植奠定了基础.     

小鼠胰岛的分离和移植

目的改进小鼠胰岛分离和移植方法。方法利用胆总管穿刺方法灌注胰腺,滤网过滤后人工挑取方法纯化胰岛;采用肾被膜下胰岛移植方法进行移植;用双硫棕(DTZ)染色方法鉴定分离纯化后的胰岛并计数;血糖仪动态检测胰岛移植后糖尿病小鼠血糖值;免疫组织化学染色观察肾脏被膜下胰岛存活情况。结果分离纯化后获得高纯度胰岛,可被DTZ染成猩红色,呈圆形或椭圆形;经计数每只小鼠可获胰岛(134±12)个;肾脏被膜下胰岛移植后血糖检测显示,移植胰岛后糖尿病小鼠可长期维持正常血糖值,移植胰岛在小鼠体内发挥了正常功能;免疫组织化学染色显示移植入的胰岛生存状态良好。结论依改进后的技术方法进行胰岛分离和移植,分离获得的胰岛纯度高、活力强,移植物功能正常、存活时间长,是一种简捷稳定的技术方法。     

成人胰岛细胞移植临床研究

目的建立新型成人胰岛细胞分离纯化方法,观察成人胰岛细胞移植的安全性与有效性。方法PFC与UW液双层冷藏胰腺,Liberase酶消化,COBE2991型专用胰岛细胞分离机分离及连续密度梯度纯化,获取高纯度与高活性的胰岛细胞。采用外科方法,将短期培养的胰岛细胞经门静脉移植到肝脏内。术后监测血糖与胰岛素用量、C肽与糖化血红蛋白水平以及肝肾功能,并与术前比较。结果42个胰腺成功分离胰岛细胞,平均数量28.5万IEQ、纯度95.7%、活率93.2%、刺激指数2.43,病原学结果均阴性。11例1型糖尿病患者实施成人胰岛细胞移植20次,每次移植平均胰岛数量为11200 IEQ/kg。采用无激素免疫抑制治疗。随访7个月~4年,7例完全撤除胰岛素,4例胰岛素用量较术前减少60%以上。术后血糖稳定维持在正常水平,C肽均超过0.5nmol/L,糖化血红蛋白基本正常,肝肾功能稳定维持正常,无胰岛移植并发症。结论新型成人胰岛细胞分离纯化方法可靠,成人胰岛细胞移植治疗1型糖尿病临床疗效较好,手术简捷,安全性好。     

成人胰岛的分离及纯化

本文作者运用自动分离方法，测定了６例健康成人非正常死亡胰岛数目，为以后的胰岛细胞培养及移植奠定基础。本研究发现成人胰腺通过胶原酶适当处理后，获得的胰岛数目多，经过Ｆｉｃｏｌ纯化后，胰岛纯度高，且其形态、功能保持完整，这为胰岛细胞移植提供了丰富的细胞来源。     

成人胰岛的分离及纯化

本文作者运用自动分离方法，测定了６例健康成人非正常死亡胰岛数目，为以后的胰岛细胞培养及移植奠定基础。本研究发现成人胰腺通过胶原酶适当处理后，获得的胰岛数目多，经过Ｆｉｃｏｌｌ纯化后，胰岛纯度高，且其形态，功能保持完整，这为胰岛细胞移植提供了丰富的细胞来源。     

半自动纯化法分离纯化成年猪胰岛细胞的实验研究

目的探索大规模猪胰岛细胞分离纯化的方法.方法采用胶原酶消化法和Ficoll液不连续密度梯度离心进行分离纯化;采用双硫腙染色、AO-PI染色、胰岛素释放试验检测胰岛的纯度和活性.结果消化后平均获取的胰岛细胞团数量为（4 387±617）IEQ/g胰腺组织;纯化后平均为（3 192±756）IEQ/g胰腺组织;获取的猪胰岛细胞平均纯度为（60.15±2.35）%,活率为（80.00±0.47）%.结论所获得的胰岛细胞有较好的纯度和良好的生物活性,显示半自动纯化法分离纯化成年云南小耳猪胰岛细胞是成功可行的,可以满足进一步异种移植的研究需要,可为大规模分离纯化猪胰岛细胞提供技术支持.     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的寻找简便、高效的大鼠胰岛分离纯化方法,并对纯化胰岛细胞的基本生物学状况进行鉴定。方法采用胰管内注射胶原酶水浴消化以及Ficoll400不连续密度梯度离心法纯化,用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO/PI染色计算胰岛细胞存活率;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和糖尿病大鼠移植判定胰岛细胞功能。结果纯化后获得(738±193)个胰岛细胞/每只胰腺,纯度为(77±13)%,纯化后细胞形态完好,活度大于95%,体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,低糖情况下胰岛素分泌量为(24.31±5.47)mIU/L,高糖情况下为(37.62±4.29)mIU/L,两者有显著性差异(P<0.05),胰岛移植后,实验组48h后血糖值降至正常,维持(3.9±1.7)d。结论采用胰管内胶原酶灌注进行大鼠胰岛分离及Ficoll400不连续密度梯度法纯化可获得较高纯度和活度的胰岛细胞。     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

成人胰岛细胞的分离与纯化

目的 探讨体外分离与纯化成人胰岛细胞的方法与可行性,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法获取的成人胰腺组织称重后,采用V型胶原酶消化法分离;再用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化;在DTZ染色显微镜下,评价胰岛细胞的数量、纯度;并用体外培养、放射免疫测定胰岛素法鉴定胰岛细胞活性。结果成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量（3600±447）个／g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,胰岛平均收获量（2140±207）个／g胰腺,纯度〉70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,测定其培养液中基础胰岛素浓度（mIU·L^-1·100^-1）分别为（3．302±1．63）、（3．504±1．10）、（2．921±1．13）。结论胶原酶消化法、Ficoll间断密度梯度离心纯化法分离纯化成人胰岛是有效的方法。     

成人胰岛细胞的分离纯化与应用

目的 探讨成人胰岛细胞分离纯化技术,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞.方法 使用LiberaseHI复合胶原酶和改良的Recordi自动胰岛细胞分离技术分离胰岛,采用COBE2991细胞淘洗仪连续密度梯度离心纯化胰岛细胞,用DTZ和AO-PI染色显微镜下评价胰岛细胞的数量、纯度和活性.结果 该组研究共分离30例胰腺的胰岛,获得胰岛细胞数量平均为(316626±191972)IEQ,平均每克胰腺收获胰岛细胞3389 IEQ,收获的胰岛纯度平均为(74.70±7.84)%,活度平均为(94.10±2.19)%,胰岛细胞刺激指数平均为(3.68±0.58).在此基础上,成功实施7人12次的成人胰岛细胞移植.结论 成功建立了改良的Recordi自动胰岛分离技术,获得大量高纯度有活性的胰岛细胞,为开展胰岛细胞临床移植提供了保障.     

犬胰岛的分离与纯化

目的探讨影响胰岛分离与纯化结果的相关因素,寻找获得足够数量、高纯度、具有活性的胰岛细胞的方法,为临床胰岛移植应用提供实验基础。方法寻找自动分离技术连续分离22只犬的胰岛,连续性密度梯度离心法纯化胰岛,观察分离纯化出来的胰岛细胞大体形态、超微结构,用葡萄糖刺激释放实验检验其活性。结果纯化前胰岛计数平均为（155040±310）IEQ／胰腺,纯化后的胰岛平均计数为（74200±185）IEQ／胰腺,纯度约为（89．4±2．6）％,回收率约为（47．8±1．3）％,活率达到（93．0±1．7）％。胰岛分离纯化的结果无论在数量上还是在质量上都随着分离技术的不断更新,操作技术的娴熟而有很大提高。葡萄糖刺激释放实验显示低糖组与高糖组比较P〈0．001,提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好。结论从犬中分离和纯化出足够数量的胰岛细胞,可用于临床研究。     

胰岛移植免疫耐受的研究进展

胰岛移植是治疗胰岛素依赖性糖尿病(IMDD)的有效手段，它能降低糖尿病并发症的发生，这是胰岛素和药物所不能解决的。但胰岛移植尚存在两个主要问题：一是胰岛来源及分离、纯化问题；二是胰岛移植的排斥反应。免疫抑制剂虽可提高移植器官或组织的存活率，但药物后的毒副作用、易破坏胰岛B细胞及终身用药等仍是尚未解决的问题。因此，诱导     

抗体预处理降低胰岛移植物免疫原性的研究

目的：探索通过体外预处理降低胰岛移植物的免疫原性，仅需小剂量短期应用免疫抑制剂提高胰岛移植的临床应用范围和移植成功率的方法。方法：分离并纯化成人胰岛细胞，用含20％胎牛血清的CMRL1066培养液37℃培养2d作为对照组；抗体组（培养1d后加MHC-Ⅱ单抗和补体培养1d）作为实验组。猪胰腺取自1～3d的新生猪，剪碎后加胶原酶P消化，Ficoll密度梯度分离纯化。洗涤后加RPMI 1640培养液37℃培养2d作为对照组；     

胰岛细胞移植治疗成人Ⅰ型糖尿病的临床应用初探

目的初步探讨成人胰岛细胞移植治疗成人Ⅰ型糖尿病的临床应用价值.方法自2006年开始经不断探索和反复的动物实验,初步掌握了成人胰岛细胞移植技术,并应用于1例临床I型糖尿病伴严重肠系膜血管病变患者.结果利用胶原酶灌注消化以及Ficoll分离液分层纯化技术的方法能够成功获得纯化的成人胰岛细胞;经胰岛素释放实验表明,实验中收获的胰岛具有良好的胰岛素分泌功能;经临床实践,该例糖尿病患者输注此胰岛后,血糖和糖化血红蛋白较移植前下降（P〈0.05）,腹泻症状较术前明显改善,体重增加了4.5kg,移植后无特殊并发症发生.结论成人胰岛细胞移植治疗I型糖尿病安全有效,此例为云南省成人胰岛细胞移植平台的建立和应用提供了理论和实验依据.     

高渗枸橼酸盐嘌呤溶液对胰岛细胞的保存研究

目的：探讨脑死亡自愿捐赠器官的供者多器官联合切取时用于人类胰岛细胞移植的胰腺获取方法及高渗枸橼酸盐漂呤溶液原位灌注后胰岛细胞的活性和冷缺血时间的关系。方法：采用高渗枸橼酸盐漂呤溶液1500－2000ml经主动脉原位灌注后，进行肾－胰腺－十二肠－脾的联合切除，切取后分离肾与胰腺－十二肠－脾，采用胶原酶P消化胰腺，分离并纯化胰岛细胞，进行胰岛细胞活性染色。结果：胰腺与肾脏经高渗枸橼酸盐漂呤溶液原位灌注满意，胰岛细胞的活性与冷缺血时间呈负相关，冷保存指数和胰岛细胞活性呈正相关。结论：在胰岛细胞移植中，经高渗枸橼酸盐漂呤溶液保存的胰腺的冷缺血时间不易超过5－6h。     

大鼠胰岛的分离和钙化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅵ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％－１     

大鼠胰岛的分离和胰岛移植

目的研究大鼠胰岛分离和移植的方法.方法采用胶原酶消化及不纯化的胰岛分离方法.用双硫腙(DTZ)法判定胰岛纯度,台盼蓝排斥试验评估胰岛存活率;SD大鼠胰岛制备物行同种异体胰岛移植后,动态检测受体血糖、胰岛素及C肽变化,并作移植部位形态学观察,以判定其功能.结果2次消化组胰岛收获量和纯度较单次消化组高,与不加甘油单次消化组相比有显著性差异(P＜0.05);胰岛活率2次消化组显著高于单次消化组(P＜0.05).在有效的免疫抑制方案下胰岛移植物能长期存活,有良好的胰岛素和C肽分泌功能,可维持正常的血糖;移植后2个月在汇管区可见较多形态完整的胰岛细胞.结论胶原酶2次消化和不纯化的分离方法,可获得较高质量和数量的胰岛移植物,且重复性好.