TIZ基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建

目的:TIZ基因全长扩增并构建携带其基因的真核表达载体,为进一步的TIZ基因在卵巢上皮癌生物学作用研究奠定基础.方法:采用PCR和DNA测序法扩增卵巢癌组织中TIZ全长基因;利用pcDNA3.1/myc-his(-)C质粒构建pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ重组质粒;采用AMP(+) LB培养筛选阳性重组质粒克隆;采用PCR、双酶切以及质粒DNA测序以确定pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ重组质粒的构建成功.结果:(1)从卵巢上皮癌组织中扩增出1 707bp大小片段,经测序和NCBI上与TIZ基因序列进行BLAST比对分析证实为TIZ基因全长.(2)所构建的pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ重组质粒经PCR、双酶切以及质粒DNA测序确定pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ(+)重组质粒构建成功.结论:成功扩增了TIZ基因全长并构建pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ(+)重组质粒,为进一步的探讨TIZ基因在卵巢上皮癌生物学作用奠定了基础.     

嗜肺军团菌PAL抗原基因的克隆及真核表达

目的 构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL,并观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法.结论PCR扩增嗜肺军团菌PAL基因,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,将经酶切、PCR扩增及序列测定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-PAL.脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞,经免疫荧光和RT-PCR检测其瞬时表达和稳定表达产物.结果 重组质粒pcDNA3.1-PAL转染NIH3T3细胞后获得了有效表达.结论 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-PAL为嗜肺军团菌核酸疫苗的进一步研究奠定了基础.     

HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达

目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。方法:利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒并用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在Eca-9706细胞中的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。结果:用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,RT-PCR检测,Western blotting检测证明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1,为进一步实验奠定基础。     

稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.     

人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体.方法:从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FD domain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和 pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定.结果:从人肝cDNA文库中扩增出1 473 bp的angioarrestin目的片段及其C-端560 bp FD domain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD 经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功.结论:成功构建了angioarrestin 和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础.     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的 研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达.方法 采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用Lipofectamine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性.结果 经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致.LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo(+)-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中.结论 实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达.     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒的构建和表达及生物学活性鉴定

目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定.方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)载体,将该重组质粒表达于真核细胞,以ELISA和Western blotting分别检测胞外及胞内sflk1-IFN-γ双功能重组蛋白的表达,并对该蛋白的生物学活性进行鉴定.结果:构建的pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ重组质粒能够在真核细胞中有效表达,且表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性.结论:成功构建和表达了sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒,为进一步研究该双功能蛋白的抗肿瘤作用打下了基础.     

人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达

目的构建人生长激素释放激素变异受体1型（GHRHR-SVT1）基因绿色荧光蛋白真核表达载体1（pEG—FP—N1）并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1／GHRHR—SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组：非转染组（对照组）,只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组（pEGFP-N1组）,加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组（pEGFP-N1／GHRHR-SVT1组）,加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果（1）pGEFP—N1／GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和BarnHⅠ双酶切产生约1080bp和4700bp2条带。（2）构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR—SVT1原始序列（AF-282259）进行对比,第54位碱基突变（A突变为T）,为无义突变。（3）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组（P〈0．01）。（4）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组（P〈0．01）。结论在适当浓度GHRH（10μmol／L）的培养基中,GHRHR—SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。     

14-3-3γ表达载体的构建及其对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建一种稳定、高表达的14-3-3γ基因真核表达质粒载体,并探索其抗子宫肌瘤的作用。方法：提取子宫肌瘤细胞总RNA,反转录后通过RT-PCR扩增14-3-3γ,并将扩增的目的基因片段插入pCMV-N-Flag真核表达质粒,构建重组质粒14-3-3γ-pCMV-N-Flag,重组体经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术导入子宫肌瘤细胞。应用WesternBlot法检测14-3-3γ蛋白的表达,应用CCK-8检测细胞增殖变化,应用Annexin V-FITC／PI双染色法经流式细胞术检测细胞凋亡。结果：①构建的14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表达载体经酶切后电泳和DNA测序,显示载体构建正确;②子宫肌瘤细胞转染重组体后的14-3-3γ表达明显高于转染前（P〈0．05）;③子宫肌瘤细胞转染重组体后,细胞增殖抑制率为52．90％（P〈0．05）;④转染重组体后肌瘤细胞的凋亡率明显高于转染前（P〈0．05）。结论：本研究成功构建14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表述质粒载体,14．3．3Y在子宫肌瘤细胞内高表达后可抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡。     

NLRP3基因真核表达载体的构建和定位

目的：构建人NLRP3真核表达载体,并证实融合蛋白在人心肌细胞中定位。方法：以人胎脑cDNA文库为模版,PCR扩增NLRP3全长编码基因,亚克隆至p3×FLAG-cmvTM-10表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测。利用激光共聚焦扫描显微镜观察FLAG-NLRP3在HCM细胞内定位。结果：NLRP3全长基因序列克隆到了真核表达载体p3×FLAG-cmvTM-10中,酶切鉴定片段大小3 111 bp。Western blotting检测到了融合蛋白FLAG-NLRP3表达,分子量约为114 kD。FLAG-NLRP3在人心肌细胞中表达,定位于细胞浆内。结论：成功构建了FLAG-NLRP3全长基因真核表达载体,FLAG-NLRP3蛋白主要定位于心肌细胞浆内。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

人心肌细胞中NLRP3融合蛋白表达的鉴定

目的：构建人NLRP3真核表达载体并证实NLRP3融合蛋白在人心肌细胞中表达。方法以人胎脑cDNA文库为模版,PCR扩增NLRP3全长编码基因,亚克隆至pCDNA3．1-myc-his A表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用流式细胞仪观察Myc-NLRP3在人心肌细胞内的作用。结果 NLRP3全长基因序列克隆到了真核表达载体 pCDNA3．1-myc-his A中,酶切鉴定片段大小为3111 bp。 Western blot检测到了融合蛋白Myc-NLRP3表达,分子量约为114 KD。 Myc-NLRP3在人心肌细胞中过表达,能够促进细胞凋亡。结论成功构建了Myc-NLRP3全长基因真核表达载体,过表达Myc-NLRP3能够促进心肌细胞凋亡。     

Survivin启动子的克隆及其在膀胱癌细胞BIU87中的活性鉴定

目的克隆Survivin启动子的有效片段,并检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的转录活性。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3BSurvivin重组质粒,用脂质体法瞬时转染BIU87及SV-HUC-1中,检测Survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3BCMV重组质粒作为阳性对照。48h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应,检测荧光素酶活性。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体,转染BIU87细胞后的荧光素酶活性为2 286.98±440.21,而SV-HUC-1荧光素酶活性为12.32±1.16,两者差异有统计学意义（〈0.01）。结论本实验成功克隆的Survivin启动子在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,其有可能作为调控元件用于膀胱癌的靶向性基因治疗。     

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。     

稳定表达细胞内病原体抗性基因1的RAW264．7细胞克隆的建立

目的：构建携带细胞内病原体抗性基因1（1pr1）,以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导人鼠巨噬细胞RAW264．7中表达．方法：KpnⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒pET32a（＋）-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,Ipr1基因定向克隆人pEGFP-C1载体,构建重组质粒载体pEGFP-C1-Ipr1．脂质法转染体培养的RAW264．7细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1-Ipr1融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测Ipr1基因转录水平的表达;West-ernBlot方法验证Ipr1蛋白水平的表达．结果：酶切鉴定获得一条约4700bp空载体条带及一条约1338bp目的片段,证明pEGFP-C1-Iprl真核表达载体构建成功．pEGFP-C1-Ipr1转染RAW264．7细胞后,WesternBlot可以检测到约Mr77×10^3的融合蛋白在RAW264．7细胞中表达,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达．结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-Ipr1,获得稳定的RAW264．7-Ipr1细胞克隆可表达Ipr1,为进一步研究Ipr1的功能奠定了基础．     

KSHV vFLIP在血管内皮细胞中的表达及其功能验证

目的：构建含卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma—associated herpesvirus,KSHV）编码的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein,vFLIP）基因的重组慢病毒表达载体,获得稳定表达vFLIP的人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,并检测vFLIP在HUVECs中活化NF-κB信号通路的能力。方法：以真核表达质粒pEF—vFLIP为模板扩增vFLIP基因,插入至慢病毒载体pHAGE—CMV—MCS—IZs-Green中构建重组质粒pHAGE—vFLIP。利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,收集过滤后的培养上清获得慢病毒悬液。利用梯度稀释法测定病毒滴度后,以一定感染复数的慢病毒感染HUVECs,通过蛋白质印迹法检测vFLIP的表达。经绿色荧光蛋白（GFP）流式分选以及蛋白质印迹法验证获得稳定表达vFLIP的HUVECs。最后,通过虫荧光素酶报告实验检测NF—κB的活性,免疫荧光染色检测NF—κB亚基p65的细胞定位,蛋白质印迹法检测IκBα蛋白的表达来评价稳定表达vFLIP蛋白的HUVECs功能。结果：核酸序列测定证实含vFLIP基因的慢病毒表达载体已构建成功。重组慢病毒感染HUVECs后可检测到vFLIP的表达。通过流式分选获得了稳定表达vFLIP的HU—VECs细胞,并且能通过抑制IKBct的降解,阻碍p65入核来活化NF—KB,从而激活经典NF—KB信号通路。结论：成功包装了含KSHVvFLIP基因的重组慢病毒,并获得具有激活NF—KB信号通路功能、稳定表达vFLIP的HUVECs株。