绿色荧光蛋白转基因胎鼠神经干细胞的超顺磁性氧化铁标记

目的探讨超顺磁性氧化铁（SPIO）标记对绿色荧光蛋白（GFP）转基因胎鼠神经干细胞（NSCs）的标记效果及标记后对其生物学特性的影响.方法采用多聚赖氨酸（PLL）介导SPIO的方法标记NSCs,用普鲁士蓝染色观察标记后NSCs内铁,比较标记和未标记NSCs的GFP表达、活力、增殖、凋亡及多向分化能力.结果普鲁士蓝染色示标记NSCS胞质内见大量蓝色颗粒,细胞的活力、增殖、凋亡及多向分化能力检测均显示两组细胞间无明显差别.结论用PLL介导SPIO标记NSCs是一种可行、安全、有效的细胞内标记方法.     

SPIO标记兔BMSCs的生物学特性与体外MRI显像研究

目的采用超顺磁性氧化铁（SPIO）作为磁探针标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）,探讨不同浓度SPIO的磁标记效率及其对细胞活力的影响观察标记干细胞体外MR显像情况。方法采用含铁不同浓度（11.2μg/ml、22.4μg/ml、44.8μg/ml）的SPIO标记兔BMSCs,分别行普鲁士蓝染色和MTT比色法检测其标记效率和BMSCs增殖活性,同时观察不同浓度磁标记细胞组（1×106、1×105、1×104和1×103细胞数/ml）和对照组（1×106细胞数/ml）的T1WI、T2WI及T2·WI体外显像信号。结果 SPIO标记BMSCs中铁含量越高,其标记率越高,含铁浓度为22.4μg/ml时磁标记率达95%且对BMSCs生长活性无明显影响。三种MR序列信号变化随细胞浓度的增加,其信号变化越明显,但在相同细胞浓度下,T2·WI信号变化率最大（P〈0.05）。结论采用含铁浓度为22.4μg/ml的SPIO来标记BMSCs,其磁标记率和安全性均很高。T2·WI是体外示踪磁标记BMSCs最佳的MR成像序列。     

大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO标记及检测

目的：研究大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCS）的分离、培养、SPIO标记,SPIO对EPCS的标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响,为进一步的实验研究奠定基础。方法：SD大鼠体重120～150 g,采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠EPCS,采用25μg/ml SPIO对其标记,比较标记和未标记的EPCS。普鲁士蓝染色观察铁标记率,台盼蓝检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖力,Calcein-AM/PI染色检测细胞活性及细胞膜完整性,AO/PI染色检测细胞凋亡率。结果：分离培养EPCS 7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的铺路石样外观。普鲁士兰染色显示SPIO（25μg/ml,24 h）对细胞的标记率接近94%;比较SPIO标记及未标记的EPCS,细胞活力分别为（94.34±0.25）%和（95.33±0.31）%;MTT法检测两组间相比差异无统计意学义（P〉0.05）;Calcein-AM/PI染色检测细胞的活性和膜完整性,存活率分别为96%和97%;AO/PI染色两组细胞的凋亡率均为5%。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养。25μg/ml浓度的SPIO细胞标记率高,对细胞毒性小,且不影响EPCS的活力、增殖及凋亡。     

探讨不同浓度 SPIO 对人成纤维细胞标记率和细胞活力影响及其MRI的实验研究

目的:探讨不同浓度超顺磁性氧化铁纳米粒子( Super-paramagnetic iron oxide,SPIO)体外标记人成纤维细胞 (Human fibroblast cells,Hfbs) 的磁性标记率、对细胞生长活力的影响,以及体外磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI) 成像的特征.方法:将单纯 SPIO(铁浓度为 200 μg/ml )、不同浓度的SPIO-多聚赖氨酸复合物分别与培养基混合( 铁的终浓度分别为 150、100、50、25 μg/ml,PLL 终浓度为 7.5 μg/ml ),加入 Hfbs 共同培养 12、24、48、72 h 后收集细胞.采用台盼蓝排除试验检测细胞活性和普鲁士蓝染色法检测细胞铁分布.运用光学显微镜、透射电镜观察铁颗粒在细胞内的位置、计算其标记率;MR 扫描观察细胞信号强度变化情况.结果:SPIO-多聚赖氨酸复合物组细胞标记率显著高于单纯 SPIO 标记组 (P<0.05 ), 台盼蓝排除试验显示,100 μg Fe/ml 及其以下浓度组细胞活力与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05 ).普鲁士蓝染色显示每个标记细胞胞质内可见多少不等的蓝染铁颗粒,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;含量在 25～50 μg Fe/ml 的培养液是 SPIO 标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育 18～24 h 即可有效标记细胞 95%～100% ;MR扫描显示标记细胞信号强度明显降低.结论:自制合成的 SPIO-多聚赖氨酸复合物可以简便、安全的标记人成纤维细胞.并且在适当浓度 25 μg Fe/ml 标记细胞不仅标记效率高,而且对细胞活力无明显影响,SPIO 标记细胞明显降低MR扫描下的细胞信号强度.     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究

目的:使用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)对成肌细胞进行体外标记,探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响.方法: 常规方法进行成肌细胞培养,应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞,用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响,台盼蓝染色及JC-1观测SPIO对细胞活力的影响.结果: 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒,单纯SPIO标记有效率为50%,脂质体包被的SPIO标记有效率为100%,电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒.SPIO标记对细胞无毒性,不影响细胞的增殖及活性.结论: 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒,可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.     

SPIO标记大鼠骨髓基质干细胞及体外磁共振成像研究

目的 探讨以多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)为转染介质介导超顺磁性氧化铁微粒(superparamgnetic ironoxides,SPIO)标记大鼠骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的合适条件,通过标记细胞的体外磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)获取最佳的磁共振扫描序列.方法 分离、纯化、培养大鼠BMSCs,SPIO和PLL以1:0.001 2混合配制氧化铁一多聚赖氨酸(F-PLL)混合液,用铁浓度分别为0、4.2、8.4、21、42、84μg/ml的FE-PLL复合物标记BMSCs.计算细胞标记阳性率,测量并绘制末标记细胞和不nd浓度铁标记细胞的MTT生长曲线;对不同浓度铁标记的细胞进行磁共振成像.分别用浓度为0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0 μg/ml的PLL同BMSCs共同培养,了解各种浓度PLL对细胞的生存是否有影响.结果 细胞的标记率分别为O%、(44.40±11.33)%、(71.97 4±8.01)%、(88.86±9.10)%、(98.24±2.94)%、100%,随着SPIO浓度的增加而增加.MTT显示在铁浓度＜42 μg/ml时FE-PLL上复合物对细胞的生长活性无明显影响,而铁浓度为84μg/ml时,细胞的生长活性受到抑制.PLL在浓度≤1.0μg/ml时对细胞的活力无明显影响;当PLL浓度为5.0μg/ml时,细胞生长明显受抑.MRI信号随FE-PLL复合物浓度的增加而增加(P＜0.05),标记细胞的信号在T1WI的改变不及在T2WI及T2*WI明显,而以T2*WI信号改变最明显(P＜0.05).结论 以PLL为转染介质,SPIO能够高效的标记BMSCs,并且在合适的浓度范围内不会影响干细胞的生长活性.     

应用超顺磁性氧化铁粒子标记组织工程关节软骨种子细胞及在体磁共振示踪的研究

目的探讨应用1．5T MRI活体示踪注入兔膝股骨髁软骨缺损关节腔内的超顺磁性氧化铁粒子（SPIO）标记的骨髓间充质干细胞（MSCs）的可行性。方法从兔骨髓中分离培养MSCs,经体外采用SPIO和BrdU双重标记后,与壳聚糖支架复合,然后注射到兔膝股骨髁自体软骨缺损关节腔中,术后1d及4、8、12周应用MR对膝关节腔内注入的磁标记MSCs进行扫描示踪,并与组织切片普鲁士染色及免疫组化BrdU对照。结果体外标记的MSCs普鲁士染色和电镜检查显示细胞胞质内含致密铁颗粒,标记细胞可正常成软骨分化。复合物注射后MRI GRET2^＊ WI序列检查显示关节腔内磁标记MSCs产生颗粒状低信号改变至少12周,不同时相信号改变在空间上呈不一致性。MRI信号改变区域与组织学检查结果基本一致。结论兔MSCs经SPIO标记后仍然具有成软骨细胞分化能力,利用1．5TMRI活体示踪注入自体软骨缺损膝关节腔内的兔磁标记MSCs分布和迁移是可行的。     

超顺磁性纳米铁标记大鼠骨髓基质干细胞的实验研究

目的研究超顺磁性纳米铁粒子（superparamagnetic iron nanoparticle,SPIO）标记骨髓基质干细胞（bone mar-row stem cells,BMSCs）对其存活、增殖能力的影响,确定最佳标记浓度。方法分离、纯化4周龄SD大鼠的BM-SCs,分别用15、25、50 mg/L浓度的SPIO标记1×106个BMSCs分别作为实验组1、实验组2、实验组3,未做标记的BMSCs为对照组。用普鲁士蓝染色法和透射电镜鉴定SPIO-BMSCs的效率,台蓝染色法观察SPIO-BMSCs的存活,MTT比色法检测SPIO-BMSCs增殖活性。结果普鲁士蓝染色显示,随SPIO浓度的升高,标记的细胞染色程度逐渐加深。透射电镜检查显示细胞内含致密铁颗粒。实验组1的细胞增殖性与对照组差异无统计学意义（P〉0.05）,实验组2和实验组3与对照组相比,死亡细胞增多,细胞增殖性受到明显抑制（P〈0.05）。结论培养基SPIO浓度在15 mg/L时,SPIO对BMSCs标记效率较高,且不影响其存活、增殖。     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的磁共振成像研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米粒子(Superparamagnetic iron oxide,SPIO)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的适当浓度和不同标记浓度对细胞的生物学活性影响,以及经MR成像的特征等.方法:选取第5代细胞进行不同浓度SPIO标记,运用光学显微镜观察铁颗粒在细胞内的位置、分布及标记率;选取适当浓度标记量,使用1.5T磁共振进行T1wI、T2WI、T2*WI扫描,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.结果:标记后的铁颗粒均位于细胞质内;含量在25～50μg Fe/ml的培养液是SPIO标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育24 h即可有效标记细胞97%～100%;SPIO标记的MSCs在T1WI,T2WI及T2*WI序列信号均降低.结论:SPIO可以简便标记MSCs.并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可有效显像磁性标记的干细胞,为下一步活体试验奠定基础.     

体外纳米磁标记骨髓间充质干细胞生物学特性及其MR成像

目的 研究超顺磁性氧化铁粒子(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)体外标记兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及MR细胞成像示踪可行性.方法 从兔骨髓中分离培养MSCs,体外不同浓度SPIO联合硫酸鱼精蛋白标记,未标记细胞设为对照组.普鲁士蓝染色和电镜检查鉴定细胞内铁颗粒,台盼蓝染色检测细胞存活,MTF法测定细胞生长曲线的变化,磁标记MSCs转入成骨、成脂肪培养基中进行诱导培养后进行鉴定,应用1.5T MR梯度回波T2加权(GRE T2 *WI)扫描序列和自旋回波T2加权(SE T2WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪.结果 普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞质内含致密铁颗粒,磁标记对MSCs活性和增殖无统计学差异(P<0.05),标记细胞可正常成骨、成脂肪分化.GRE T2*WI序列和SE T2WI序列提示与未标记细胞信号强度(sI)相比,1×106(标记细胞)、5×105(标记细胞)SI均显著性下降(P<0.05),其中GRE T2*WI的信号强度衰减率(△SI)显著高于T2WI序列(P<0.05).在2个序列中1×106(标记细胞)△SI均高于5×105(标记细胞)△SI,但不具有显著性差异(P>0.05).结论 SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记MSCs,磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响.磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变.应用1.5T MR成像示踪标记细胞可行,以GRE T2*WI序列成像最为敏感.     

SPIO标记骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死大鼠的示踪研究

目的探讨超顺磁性氧化铁微粒(SPIO)体外标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)及体内示踪移植入大鼠心肌梗死心脏的BMSCs的能力。方法使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记BMSCs。采用普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒,流式细胞术检测细胞活力,将经过SPIO标记的干细胞移植入心肌梗死大鼠心脏,应用1.5TMRI系统行磁标记干细胞成像。超声心动图检测各组心脏的左室射血分数(EF),左室舒张末期内径(LVIDd),左室收缩末期内径(LVIDs)及短轴缩短率(FS)。结果普鲁士蓝染色显示,SPIO标记的BMSCs细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,标记效率为(99.81±1.57)%;与正常未标记细胞相比较,细胞的活力差异无统计学意义(P0.05)。标记了SPIO的BMSCs体内MRI成像时显示,细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞。超声心动图显示,PBS组FS移植前后没有明显变化,BMSC组FS从移植前的(23.1±1.88)%上升到第1周的(31.28±4.15)%。BMSC组EF在移植前是(51.13±5.07)%,第1周时上升到(60.12±8.40)%。结论 SPIO能成功地标记BMSCs,且对BMSCs的活力无明显影响。BMSCs移植后能改善心梗大鼠的心功能。SPIO标记的BMSCs移植后在大鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。     

干细胞的磁性标记及肝内活体磁共振示踪

目的:探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记骨髓干细胞的方法和标记细胞在肝脏内的磁共振活体成像特点和衰减规律.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,用SPIO标记细胞并在超声引导下局部注入兔肝脏内,然后经磁共振T1WI, T2WI和FFE序列进行移植细胞团的成像示踪.结果:体外标记的骨髓干细胞见黑色铁颗粒位于细胞胞质内,标记后细胞的生长曲线与正常细胞一致. 标记的移植细胞团在肝内T1WI, T2WI和FFE序列上均呈低信号,以FFE图像信号减低最为明显并有面积增大效应. 标记细胞的信号减低区在T1WI, T2WI和FFE序列图像上分别至注射后30, 30 和45 d仍和注射前信号差异有统计学意义(P＜0.05),并分别持续至注射后38, 38 和60 d低信号才消失.结论:SPIO可以简便、有效地标记骨髓干细胞,且对细胞的活性没有影响;MRI可对标记后的移植细胞进行活体内示踪,并可长期动态观察,这对进一步的实验研究和疗效观察研究具有重要意义.     

大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的 应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性.方法 分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞.将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem 200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜.采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价.体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像.结果 该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低.结论 利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞.     

超顺磁性氧化铁(SPIO)与多聚赖氨酸(PLL)纳米粒的制备、结构验证及其空间结构表征

 目的  探讨葡聚糖修饰的超顺磁性氧化铁(super-paramagnetic iron oxide,SPIO)与多聚赖氨酸(polylysine,PLL)纳米粒的制备及其结构验证和空间结构表征。方法  在共沉淀法制备葡聚糖修饰的SPIO基础上,加入PLL制备出一种新的SPIO-PLL纳米粒,利用粒度电位分析仪、透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)对SPIO-PLL的粒径、电位、形貌学进行检测;高效液相凝胶色谱法(gel permeation chromatography,GPC)、红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)及核磁共振氢谱法(1HNMR)对SPIO PLL连接成功与否进行验证;高精度的原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)对SPIO-PLL的结构、形态及连接状态进行空间结构表征。结果  粒度电位分析和TEM结果显示SPIO-PLL的平均粒径为7.37 nm,平均电位为13.6 mV;GPC、FTIR及1HNMR结果显示SPIO及PLL之间已经成功连接;高精度AFM清楚显示出SPIO与PLL之间以亚胺键形式稳定相连。 结论  成功制备出一种性质稳定、粒径较小的新型SPIO-PLL纳米粒,这将对随后的肿瘤特异性探针制备奠定一定的基础。     

Superparamagnetic Iron Oxide Labeling of Neural Stem Cells and 4.7T MRI Tracking in vivo and in vitro

Neural stem cells were labeled with superparamagnetic iron oxide (SPIO) and tracked by MRI in vitro and in vivo after implantation. Rat neural stem cells were labeled with SPIO combined with PLL by the means of receptor-mediated endocytosis. Prussian blue staining and electron mi-croscopy were conducted to identify the iron particles in these neural stem cells. SPIO-labeled cells were tracked by 4.7T MRI in vivo and in vitro after implantation. The subjects were divided into 5 groups, including 5×105 labeled cells cultured for one day after labeling, 5×105 same phase unla-beled cells, cell culture medium with 25 μg Fe/mL SPIO, cell culture medium without SPIO and dis-tilled water. MRI scanning sequences included T1WI, T2WI and T2WI. R2 and R2 of labeled cells were calculated. The results showed: (1) Neural stem cells could be labeled with SPIO and labeling efficiency was 100%. Prussian blue staining showed numerous blue-stained iron particles in the cyto-plasm; (2) The average percentage change of signal intensity of labeled cells on T1WI in 4.7T MRI was 24.06%, T2WI 50.66% and T2WI 53.70% respectively; (3) T2 of labeled cells and unlabeled cells in 4.7T MRI was 516 ms and 77 ms respectively, R2 was 1.94 s-1 and 12.98 s-1 respectively, and T2 was 109 ms and 22.9 ms, R2 was 9.17 s-1 and 43.67 s-1 respectively; (4) Remarkable low signal area on T2WI and T2WI could exist for nearly 7 weeks and then disappeared gradually in the left brain transplanted with labeled cells, however no signal change in the right brain implanted with unlabeled cells. It was concluded that neural stem cells could be labeled effectively with SPIO. R2 and R2 of labeled cells were increased obviously. MRI can be used to track labeled cells in vitro and in vivo.